[0003] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及分子标记及其应用。

[0004] 镉(Cd)被视为最具毒性的环境污染物之一。土壤中的Cd一方面来源于矿质风化、铁锰共沉、大气干湿沉降等自然条件，另一方面来源于化肥、农药和土壤改良剂的施用及污水灌溉等人为因素[1]。据不完全统计，我国农田重金属Cd、Pb污染面积达2万公顷，而我国每年生产的Cd含量超标农产品达14.6亿kg，且呈现递增的趋势[2]。土壤-作物-食物间的迁移分配是土壤重金属影响人体健康的主要途径之一[3-5]。水稻是我国主要的粮食作物，全国60％以上的人口以稻米为主食。因此，水稻生产的安全关系到我国整个粮食安全的大环境。

[0005] 多年来，国内外专家主要针对水稻不同器官对重金属富集的特征以及不同水稻品种对Cd富集能力差异等方面进行了大量的研究。Morishita等[6]研究发现，粳稻、籼稻、爪洼稻、杂交稻体内Cd含量为2—73μg·kg-1，其中籼稻和杂交稻对Cd的吸收积累较其它两种类型有明显优势。当土壤Cd浓度为100mg·kg-1，水稻不同品种茎叶内浓度变化范围是24—140mg·kg-1，积累量变化范围为1—14mg·pot-1[7]。基于部分水稻品种对Cd的吸收和积累能力较强，国外学者开始利用Cd富集水稻品种进行Cd污染农田修复。莫争等[8]认为水稻不同器官对土壤重金属Cd和Pb吸收规律为根＞茎叶＞籽粒。龚伟群等[9]研究表明，杂交水稻对外源Cd的吸收及其在籽粒中的富集受土壤类型的影响大于品种基因型。

[0006] 同时，科研工作者对水稻镉富集能力的研究中发现，部分水稻品种在镉污染的土壤中生长，其籽粒中镉富集指标在安全范围内，也就是说，部分品种即使在镉污染的土壤中依然能够生产出安全的稻谷，我们定义此性状为拒镉性状，这种性状是由基因控制的。而国内外对此方面的研究极少，如果能够定位出与拒镉性状相关的基因，并开发与之紧密连锁的DNA分子标记，则可以利用分子标记辅助育种技术，指导水稻选育工作，大大提高拒镉水稻的选育水平以及选育效率，对水稻粮食安全方面意义重大。但是，现阶段与拒镉相关的基因以及与基因紧密连锁的DNA分子标记，仍有待挖掘。

[0007] 参考文献：

[0008] 1.Alloway B J,Steinnes E.Anthropogenic additions of cadmium to soils.Cadmium in Soils and Plant,1999,85:97-123.

[0009] 2.赵其国，周炳中，杨浩.江苏省环境质量与农业安全问题研究.土壤，2002,34(1)：18.

[0010] 3.刘洪莲，李艳慧，李恋卿，等.太湖地区某地农田土壤及农产品中重金属的分布及风险评价.农业与环境学报，2006,6(5)：60-63

[0011] 4.USEPA.Part-503Standards  for  the  use  or  disposal  of sewagesludge.Federal Register,1993,58:9387-9404.

[0012] 5.Chang A C,Page A L.Cadmium uptake for Swiss chard grown on composted sewage sludge-treated field plots:Plateau or time bomb.J Environ Qual,1997,26(1):11-19.

[0013] 6.Morishita T,Fumoto N,Yoshiawa T,Kagawa K.Varietal differences in cadmium levels of rice grains oh Japonia,Indica and Hybird varieties produced in the same plot of a field.Soil Science,1987,33(4):629-637.

[0014] 7.李坤权,刘建国,陆小龙,杨建昌,张祖建,朱庆森.水稻不同品种对镉吸收及分配的差异.农业环境科学学报,2003,22(5):529-532.

[0015] Li K Q,Liu J G,Lu X L,Yang J C,Zhang Z J,Zhu Q S.Genotype difference in accumulation and distribution of cadmiurn in rice plant.Journal of Agro-Environment Science,2003,22(5):529-532.(in Chinese)

[0016] 8.莫争，王春霞.重金属Cu、Pb、Zn、Cr、Cb在水稻植株中的富集和分布.环境化学，2002,21(2)：110-116.

[0017] 9.成颜君，龚伟群，李恋卿，等.2种杂交水稻对2种不同土壤中Cd吸收与分配的比较.农业环境科学学报，2008,27(5)：1895-1900.

[0071] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

[0072] 实施例1：水稻F2代分离群体的构建以及F2代籽粒镉含量表型数据采集[0073] 父本为籼型常规稻品种9311，在镉土壤背景值为4.3mg/kg的镉污染土壤中种植，其籽粒中镉含量超过0.8mg/kg，远远大于国家标准0.2mg/kg，为籽粒镉高积累品种，不具有拒镉性状。

[0074] 母本为籼型光温敏不育系KT-27S，该品种属籼型两用核不育系。在镉土壤背景值为4.3mg/kg的镉污染土壤中种植，其籽粒中镉含量为0.073mg/kg，低于国家标准0.2mg/kg，为籽粒镉低积累品种，具有拒镉性状。

[0075] 父本和母本杂交得到F1，F1代自交产生F2代群体，共237个单株。将F2群体种植在在镉土壤背景值为4.3mg/kg的镉污染土壤中，待结实后测定F2代中每个个体的籽粒镉含量，获得表型数据。

[0076] 根据表型鉴定结果，计算分离比，使用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，使用SPSS17.0对结果进行卡方检测。

[0077] 性状调查结果：在237个F2后代中，其中175个个体种子中镉含量低于0.1mg/kg，低于国家标准0.2mg/mg，具有拒镉性状；另外62个个体种子中镉含量高于0.8mg/kg，远远高于国家标准，不具有拒镉性状。

[0078]

[0079] 卡方检测表明，拒镉性状的分离比约为3:1，符合孟德尔的一对基因的分离规律。因此，拒镉性状为显性单基因控制的质量性状。

[0080] 实施例2：基因组DNA的提取

[0081] 用改良的CTAB法分别提取针对实施例1中的父母本、F1代、以及F2代个体的基因组DNA，具体方法如下：

[0082] 1)取样：取幼嫩的叶片1g左右，置于2ml离心管中。

[0083] 2)样品冷冻抽干：取好的样品家研磨珠，打开管盖放入真空冷冻抽干机，-50℃条件下持续冷冻抽干12小时以上(一般冷冻抽干过夜)。

[0084] 3)样品研磨：将冷冻抽干的样品置于高通量机械研磨仪中，启动程序研磨，将样品粉碎。机械研磨仪程序运行需5分钟，通量为96份样品/5分钟。

[0085] 4)样品研磨充分后，在管内加入65℃预热1h的CTAB提取液，混匀，65℃水浴40分钟，期间每隔5分钟颠倒混匀一次。

[0086] 5)将水浴后的样品从水浴锅内拿出，冷却至室温后，加入与CTAB等体积的氯仿(三氯甲烷/异戊醇按照24:1比例混合)，轻轻混匀10分钟，至下层液体变为深绿色。(本步骤需在通风厨内操作)

[0087] 6)混匀后将离心管转入高速离心机内离心，转速12000rpm，离心15分钟。离心后样品上层为清夜。

[0088] 7)抽取适量的上清液于1.5ml离心管中，并加等体积的异丙醇，轻轻混匀(此时可以看到有絮状沉淀析出)，然后将样品置于-20℃的冰柜30分钟，以沉淀DNA。

[0089] 8)样品冷冻30分钟后转移至高速离心机内离心，转速12000rmp，离心10分钟。

[0090] 9)弃掉清夜，DNA沉淀用75％乙醇洗涤2次，洗涤后将乙醇倒掉，敞开管口放置于通风厨内晾干。

[0091] 10)待乙醇完全挥发后，加入50微升TE缓冲液(加RNA酶)溶解DNA，并于-20℃保存。

[0092] 实施例3：基因定位和分子标记开发

[0093] (1)遗传图谱构建

[0094] 针对实施例2中获得的F2代个体的基因组DNA，基于RAD-seq的基因分型技术对F2群体的个体进行基因分型，获得F2群体的基因型数据。

[0095] 用MapMaker 3.0软件(Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0，S Lincoln,M Daly,E Lander-Cambridge,MA:Whitehead Institute,1992，通过参照将其全文并入本文)进行遗传连锁图谱绘制，得到遗传连锁图。

[0096] (2)基因定位

[0097] 根据实施例1获得的F2群体的表型数据，结合群体基因型以及遗传连锁图，通过WinQTLCart 2.5软件进行QTL定位。

[0098] 由于父母本在拒镉性状上有明显的差异(父本不具有拒镉性状，母本具有拒镉性状)，对F2个体进行性状分析，并根据性状和marker之间的连锁关系将拒镉性状基因定位在遗传图谱上。

[0099] 具体地，针对实施例1中获得的F2群体，将F2群体的个体表型，与父本型性状相似的记为a，与母本型性状相似的记为b，性状居于父本和母本之间的记为h。得到全部个体的表型数据，将个体的表型数据与之前得到的基因型数据进行比较，从而将水稻拒镉基因定位在遗传连锁图谱上。结果显示，其中一个水稻拒镉基因定位在11号染色体26584352至27461103区间内，长度约876751bp。

[0100] (3)分子标记开发

[0101] 对实施例2中获得的母本和父本的基因组DNA进行全基因组重测序(RAD-seq)，然后根据RAD-seq的测序结果，利用SOAP软件比对测序reads，然后用SOAPsv寻找两者基因组片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。

[0102] 结果，选择靠近拒镉性状基因所在区段的标记R112741(SEQ ID NO：3所示的核酸序列)作为候选。

[0103] R112741的核苷酸序列如下(43bp)：

[0104] TAACTATACCATTAAAACCCTATATTTGTGATATTTTAAGGCG(SEQ ID NO：3)。

[0105] 实施例4：分子标记的拒镉性状相关性验证

[0106] 针对实施例3中确定的与水稻拒镉性状基因紧密连锁的分子标记R112741设计引物，以便对分子标记R112741(SEQ ID NO：3所示的核酸序列)进行验证，具体如下：

[0107] 针对上述分子标记设计引物，引物序列如下所示：

[0108] R112741-F：GCAAGATGGAGGAATGGTTT(SEQ ID NO：1)；

[0109] R112741-R：AATGTGCTGCCATTCAAGCT(SEQ ID NO：2)。

[0110] 利用上述引物，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该标记的多态性和扩增稳定性。

[0111] 具体地，以实施例2中提取的父本、母本、F1代、或F2代的基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，其中，

[0112] PCR反应体系如下：

[0113]无菌水 20.2μl
10×Buffer(含Mg2+) 2.5μl
dNTPs(25mM) 0.15μl
Taq酶(5U/μl) 0.15μl
正向引物R112741-F 0.5μl
反向引物R112741-R 0.5μl
模板 1.0μl
总体积 25μl

[0114] PCR反应程序如下：

[0115] 94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。

[0116] 接着，将各PCR扩增产物取部分进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1和图2。如图1所示，父本扩增产物约为500bp大小的扩增片段，母本扩增产物约为450bp大小的扩增片段，杂交F1代则同时含有这两个扩增片段。图2中显示了部分F2代个体的扩增产物的电泳检测结果，不具有拒镉性状(籽粒镉含量大于0.8mg/kg)的单株仅扩增出500bp的条带，部分具有拒镉性状(籽粒镉含量小于0.1mg/kg)的单株均仅扩增出450bp的条带，另外部分具有拒镉性状的单株(籽粒镉含量小于0.1mg/kg)含有两个扩增片段。由此，证明该分子标记R112741(SEQ ID NO：3所示的核酸序列)在父母本之间具有多态性，该分子标记与水稻拒镉性状紧密相关。

[0117] 然后，利用3730测序仪对各扩增产物进行测序，结果，母本及F2代中具有拒镉性状的纯合单株扩增条带约450bp，与父本及F2代中不具有拒镉性状的纯合单株扩增条带约500bp相比缺失了一些序列，该序列即为分子标记R112741(SEQ ID NO：3所示的核酸序列)。
该分子标记的引物可以直接应用于拒镉水稻分子育种实践，针对父本籼型常规稻9311的不具有拒镉性状进行定向改良。

[0118] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0119] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。