技术领域
[0001] 本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及山羊羊毛卷曲性状相关的SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记、引物对、试剂盒在山羊选育中的用途，以及检测山羊羊毛卷曲性状的方法。
相关背景技术
[0002] 中国是世界上山羊品种资源最为丰富的国家，根据山羊用途不同可分为绒用、毛用、裘用、羔皮、肉用和奶用山羊等。而山羊毛一般分为内、外两层。内层由皮肤中的次级毛囊形成的无髓毛纤维，山羊绒细而柔软，光泽良好，保暖性能强，素有“软黄金”的美称，通常作为我国重要的出口创汇纺织材料。外层粗毛由初级毛囊生长形成，与绵羊毛相比，弯曲少。山羊毛主要用于织造地毯、毛毯、各种粗呢料、毛笔、帐篷等。通过对各种羊毛大量加工的结果进行统计分析，发现羊毛纤维的卷曲度对纤维性能和纱线、织物性能存在着一定的影响。在地毯织造过程中，采用卷曲毛一般来说可以提高抗压性和手感。但羊毛的卷曲有时对加工是不利的，特别是过大的卷曲度对精纺加工及其产品不利。毛纤维卷曲度增加会增加梳毛过程中纤维的断裂和落毛，卷曲度也影响到并合过程中的牵伸力。因而，生产养殖中需要根据实际需求培育羊毛卷曲度不同(卷毛或直毛)的山羊品种。但是，传统的选择手段难以取得有效进展。分子标记辅助选择，可以通过影响选择时间、选择强度以及准确性而极大地提高这类性状的选择效果。
[0003] 目前应用较广泛的分子遗传标记技术有：限制性片段长度多态分析技术(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机引物扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性分析技术(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)等。其中，SNP标记具有遗传稳定、突变率低、便于自动化检测等优点，因此开发与山羊羊毛卷曲相关的SNP遗传标记将对培育所需羊毛卷曲的山羊新品种(系)产生重大影响。其中，目前关于山羊羊毛卷曲的遗传标记的研究多基于已在其它品种或物种中发现的毛发卷曲的候选基因。这些在山羊羊毛卷曲遗传机制研究中发现的羊毛卷曲相关遗传标记多是初步的结果，并且局限于已有候选基因，利用这些结果，还难以对山羊羊毛卷曲性状做出较准确的选择。因而，目前，在全基因水平上挖掘与羊毛卷曲性状相关的遗传标记仍然很有必有。
具体实施方式
[0037] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0038] 实施例1 与山羊羊毛卷曲相关的SNP标记的获得
[0039] 发明人通过RAD-seq及全基因组关联分析(GWAS)挖掘青山羊羊毛卷曲相关遗传标记，利用这些标记可以提高羊毛卷曲性状选择的准确性。具体步骤如下：
[0040] 1、青山羊血液样品的采集和DNA的提取
[0041] 1)457份血液样品均采自山东永旺畜牧发展有限公司青山羊，羊毛卷曲性状统计如表1。
[0042] 2)基因组DNA采用酚-氯仿法提取。
[0043] 表1 青山羊羊毛卷曲性状统计结果
[0044]性状 直毛 卷毛 合计
个体数 431 26 457
[0045] 2、RAD-seq文库构建
[0046] 文库构建方法 参考(Rapid SNP Discovery and Genetic Mapping Using Sequenced RAD Markers)，具体如下：
[0047] 1)用Taq I对基因组进行酶切，连接P1接头(含有barcode)；
[0048] 2)随机打断，连接P2接头；
[0049] 3)通过PCR筛选同时带有P1和P2接头的序列；
[0050] 4)选取400bp-700bp的片段进行测序，其中，每个样本平均得到1.2G的数据，平均测序深度15×。
[0051] 3、全基因组关联分析
[0052] 采用Plink软件进行全基因组关联分析(GWAS)，从14万个SNP中筛选出1个与山羊直卷毛性状密切显著相关的SNP，具体信息如图1和表2。
[0053] 图1显示了该SNP标记位点的曼哈顿图。如图1所示，横坐标为染色体编号，纵坐标为关联分析-log P值，点线为基因组水平5％显著的阈值线(6.6)，单核甘酸多态性标记的颜色对应特定染色体。
[0054] 表2 该SNP位点的统计信息
[0055]染色体 位置a 等位基因b 最小等位基因频率 Pc
Chr26 5119569 C/T 0.037 3.10×10-10
[0056] 注：a.用RAD-seq得到的SNP侧翼序列进行BLAST，将其定位在基因组中(Capra hircus CHIR_1.0)。
[0057] b.该位点有51个体基因型缺失。c.关联分析中用χ2检验得到的P值。
[0058] 由图1、表2所示的全基因组关联分析结果及统计信息表明：该SNP位点与山羊直-10卷毛性状极显著相关(p＝3.10×10 )。进而，表明SNP位点为判断山羊羊毛直卷相关的SNP标记。
[0059] 4、SNP位点基因型与羊毛卷曲个体数的统计
[0060] 457份青山羊个体该SNP位点的基因型及表型统计信息如表3，并对不同基因型直毛出现概率进行了t检验，结果表现出显著差异(p＜0.05)。
[0061] 表3 该SNP位点基因型与个体羊毛卷曲的信息
[0062]
[0063] 表3所示的统计信息表明：该SNP位点的CC、CT基因型个体中直毛个体比重极显著高于TT基因型的直毛个体比重(p＝0.000)。进而，表明该SNP位点的CC和CT基因型可以作为判断山羊直卷毛性状的重要标准。
[0064] 实施例2 与山羊羊毛卷曲相关的SNP标记的测序验证
[0065] 2.1提取待测青山羊血液样品中的基因组DNA
[0066] 待测青山羊血液样品来自山东翰龙羊业股份有限公司青山羊，随机选取5份，按照实施例1中所述的DNA提取方法抽提基因组DNA。
[0067] 2.2扩增含SNP位点的核苷酸片段
[0068] 以前述提取获得的各待测青山羊血液样品中的基因组DNA为模板，利用正向引物F：CAAGGTTTAACAAGGCAGTT(SEQ ID NO：2)和反向引物R：CTGTTGATCCAAGTGAACTT(SEQ ID NO：3)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。该PCR扩增的扩增体系以20μl计为：25-50ng/μl的模板DNA2μl，10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3所示的引物各0.3μl，10mmol/L的dNTP mix 0.5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为双蒸水；该PCR扩增的反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，35个循环；
72℃ 5分钟。
[0069] 2.3测序识别SNP位点基因型
[0070] 前述步骤中所获得的PCR产物先经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，结果为单一特异性条带后(见图2，如图2所示，左侧为电泳结果图，目标片段为270bp，右侧为对应的Marker图)，再于ABI3730测序仪上进行单向测序，识别SEQ ID NO：1序列中501bp处(即本发明的SNP标记)的基因型。其中，CC和CT两种基因型的测序峰图分别如图3a、3b所示。其中，如图3所示，测序时采用了反向引物序列，所以测得的序列为反向互补序列。
[0071] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0072] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
