[0001] 本实用新型涉及一种检测试剂盒，尤其是涉及一种成骨不全致病基因COL1A1 产前检测试剂盒，属于医疗检测技术领域。

[0002] 成骨不全(osteogenesis imperfecta，OI)是一种先天性骨骼发育障碍性疾病，又称脆骨病或脆骨-蓝巩膜-耳聋综合征。以骨量低下、骨脆性增加和反复骨折为主要特征，还可表现有蓝巩膜、牙本质发育不全、关节韧带松弛、听力下降、心瓣膜病变和身材矮小等复杂骨骼外表现，是一种由于间充质组织发育不全，胶原形成障碍而造成的先天性遗传性疾病。

[0003] 成骨不全是一组具有表型异质性的单基因遗传性骨病，其新生儿的患病率为1／10000-20000。根据表型该病具有常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传，男女发病无差别。1979年Sillence提出的从遗传学角度对该病进行分型：Ⅰ-Ⅳ型；随着对该病致病原理的研究，根据临床表现和遗传特征，该疾病被分为 14 种类型(ⅠⅪⅤ型)，已经发现OI的致病~
基因已达19种。研究表明，OI的致病目前认为主要是由编码Ⅰ型胶原基因突变所引起，约
90％的成骨不全患者有COL1A1 基因的突变。COL1A1 基因位于 17 号染色体长臂第二区 
1.3 带和2.1 带(17q21. 3，17q22. 1)，起于 45 616 455 bp，止于45 633 991 bp，全长
17537 bp。其中rs72656353为该基因的一个致病突变位点，由A突变为G。

[0004] 目前产前诊断主要依靠超声学检查胎儿的骨骼系统，可早期发现先天性骨发育障碍疾病，但是，由于该病分为先天型及迟发型两种，迟发型不能被检测出来。随着分子诊断技术的迅速发展，基因检测手段日益发展，在孕妇血液中，约有10%-15%的cfDNA来自于胎盘滋养层，这意味着可以通过母亲外周血测序分析其中的cfDNA信息有一部分是胎儿的，所以产前胎儿基因检测常用来辅助鉴定由于基因突变引起的疾病，在OI致病基因诊断技术应用过程中，基因测序是当前比较常用的成骨不全致病基因检测方法，但是需要昂贵的检测设备和繁琐的鉴定流程，这就对相关检测部门的实验条件提出了更高的要求，因此会存在着较多的局限性，不利于大范围推广应用。繁琐的鉴定流程就意味着时间的延长，就会增加整个过程中污染的可能性，而且对于需要检测的人群来说会大量增加等待的时间，同时也会产生较高的费用，这些都意味着现有的检测技术无法满足在人群中普遍筛查的要求，适用性不强。实用新型内容

[0005] 本实用新型主要是针对现有成骨不全致病基因COL1A1产前检测耗费时间长、费用高和不适用于大范围推广的问题，提供一种判定方式更加直观、操作简便、成本低、实用性强的成骨不全致病基因COL1A1产前检测试剂盒。

[0006] 本实用新型的目的主要是通过下述方案得以实现的：

[0007] 一种成骨不全致病基因COL1A1产前检测试剂盒，包括具有内腔的盒体及与所述盒体的后侧壁相连的盒盖，所述盒体内横向设有隔板，所述隔板将所述盒体内部分割成两个小槽，所述两个小槽分别为避光槽和试剂槽，所述避光槽内设有固定层Ⅰ，所述试剂槽内设有固定层Ⅱ，所述固定层Ⅰ上设有若干小孔Ⅰ，所述固定层Ⅱ上设有若干小孔Ⅱ和大孔，所述避光槽和试剂槽的内壁上对称设置有用于放置固定层Ⅰ的放置板，所述试剂槽的内壁上对称设置有用于放置固定层Ⅱ的放置板，所述盒体内部位于放置板下方的位置设置有冰盒。

[0008] 作为优选，所述盒盖包括前盒盖和后盒盖，所述前盒盖和后盒盖之间连接有条形磁铁Ⅰ，所述隔板上端面设置有与条形磁铁Ⅰ配合使用的条形磁铁Ⅱ，所述条形磁铁Ⅱ的长和宽与隔板的长和宽相等，所述条形磁铁Ⅰ的长和宽与条形磁铁Ⅱ的长和宽相等，前盒盖和后盒盖中间位置有条形磁铁Ⅰ，其长宽与隔板长宽相等，用于吸附隔板上的磁铁，可以确保在取用其他试剂的时候使避光槽仍处于避光的环境。

[0009] 作为优选，所述后盒盖与所述盒体的后侧壁的上端部枢转连接，方便进行试剂盒的关闭和开合，使用较为方便，固定效果好。

[0010] 作为优选，所述前盒盖远离后盒盖的一端部向下弯折延伸形成延伸部，所述延伸部中间设置有磁力扣Ⅰ，所述盒体正面的上部设置有与磁铁扣Ⅰ配合使用的磁力扣Ⅱ。

[0011] 作为优选，所述固定层Ⅰ中的小孔Ⅰ装有试剂管Ⅰ，所述试剂管Ⅰ分别放置探针试剂和内参探针试剂，所述固定层Ⅱ中的小孔Ⅱ装有试剂管Ⅱ，所述试剂管Ⅱ分别放置引物和微滴发生油，所述固定层Ⅱ中的大孔装有试剂瓶，所述试剂瓶放置反应试剂预混液，试剂管或者试剂瓶上设有用于标记内部试剂的标签，所述试剂管或者试剂瓶的盖上也设有用于标记内部试剂的标签。

[0012] 作为优选，所述小孔Ⅰ设置有两排，每排的数量为8-10个；所述小孔Ⅱ设置有两排，每排的数量为5-8个；所述大孔设置在小孔Ⅱ的一侧，数量为1-2个。

[0013] 作为优选，所述小孔Ⅰ、小孔Ⅱ和大孔的上部均呈圆柱形，其下部直径逐渐变小，这样小孔Ⅰ、小孔Ⅱ和大孔与试剂管或试剂瓶紧密结合，在运输途中不易滑出。

[0014] 作为优选，所述盒体为长方体，有助于在冰箱中放置，避免浪费储存空间，且所述盒体和盒盖的外壁均设有一层防潮层，用于试剂的防潮。

[0015] 作为优选，所述盒体用PE塑料制成，可塑性好，不易损坏，所述固定层Ⅰ和固定层Ⅱ为海绵或珍珠棉。

[0016] 作为优选，所述冰盒内装有制冷剂，所述制冷剂采用聚乙烯材料配制而成，使试剂处于低温环境中，便于试剂的运输及保存。

[0017] 因此，本实用新型具备下述优点：（1）该试剂盒能防潮避光，且试剂盒体积小，存储占用空间小，运输方便；（2）通过条形磁铁Ⅰ和条形磁铁Ⅱ的配合，可以确保在取用其他试剂的时候使避光槽仍处于避光的环境；（3）通过PCR检测技术，根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度，与内参基因比对，可以推算出是否发生基因突变，并且可以对每份样本检测结果进行实时监控和评价，结果判定方式更加直观准确，同时具有操作步骤简单，单个样品检测成本相对低。

[0022] 下面通过实施例，并结合附图，对本实用新型的技术方案作进一步具体的说明。

[0023] 如图1、2所示，本实用新型提供一种技术方案，一种成骨不全致病基因COL1A1 产前检测试剂盒，包括具有内腔的盒体1及与所述盒体1的后侧壁相连的盒盖，所述盒体1为长方体，有助于试剂盒在冰箱中放置，避免浪费储存空间，盒体1内横向设有隔板2，所述隔板2将所述盒体1内部均分割成两个小槽，后面小槽为避光槽3，前面小槽为试剂槽4，所述避光槽3内设有固定层Ⅰ5，所述试剂槽4内设有固定层Ⅱ6，所述固定层Ⅰ5上设有两排小孔Ⅰ7，每排小孔Ⅰ7等间距设置为9个，所述固定层Ⅱ6上右侧设有两排小孔Ⅱ8，每排小孔Ⅱ8等间距设置为6个，固定层Ⅱ6上左侧设有一个大孔11，所述小孔Ⅰ7、小孔Ⅱ8和大孔11的上部均呈圆柱形，其下部直径逐渐变小，这样小孔Ⅰ7、小孔Ⅱ8和大孔11与试剂管或试剂瓶紧密结合，在运输途中不易滑出；所述固定层Ⅰ5中的小孔Ⅰ7装有试剂管Ⅰ，所述试剂管Ⅰ分别放置探针试剂和内参探针试剂，所述固定层Ⅱ6中的小孔Ⅱ8装有试剂管Ⅱ，所述试剂管Ⅱ分别放置引物和微滴发生油，所述固定层Ⅱ6中的大孔11装有试剂瓶，所述试剂瓶放置反应试剂预混液，试剂管或者试剂瓶上设有用于标记内部试剂的标签，便于在试剂管或者试剂瓶拿出试剂盒后进行不同试剂的区分，同时所述试剂管或者试剂瓶的盖上也设有用于标记内部试剂的标签，不用取出试剂瓶试剂管或者试剂瓶即可对装有不同试剂的试剂瓶进行区分，便于操作。

[0024] 如图3所示，所述避光槽3和试剂槽4的前后壁上对称设置有用于放置固定层Ⅰ5的放置板9，所述试剂槽4的前后壁上对称设置有用于放置固定层Ⅱ6的放置板9，所述盒体1内部位于放置板9下方的位置设置有冰盒10，所述冰盒10内装有制冷剂，所述制冷剂采用聚乙烯材料配制而成，所述盒体1和盒盖的外壁均设有一层防潮层，所述盒体1用PE塑料制成，所述固定层Ⅰ5和固定层Ⅱ6为海绵。

[0025] 所述盒盖包括前盒盖12和后盒盖13，所述前盒盖12和后盒盖13之间铰接有条形磁铁Ⅰ14，所述隔板2上端面设置有与条形磁铁Ⅰ14配合使用的条形磁铁Ⅱ15，所述条形磁铁Ⅱ15的长和宽与隔板2的长和宽相等，所述条形磁铁Ⅰ14的长和宽与条形磁铁Ⅱ15的长和宽相等，所述后盒盖13与所述盒体1的后侧壁的上端部枢转连接，所述前盒盖12远离后盒盖13的一端部向下弯折延伸形成延伸部16，所述延伸部16中间设置有磁力扣Ⅰ17，所述盒体1正面的上部设置有与磁铁扣Ⅰ配合使用的磁力扣Ⅱ18，方便进行试剂盒的关闭和开合，使用较为方便，固定效果好。

[0026] 该试剂盒能防潮避光，且试剂盒体积小，存储占用空间小，运输方便；通过条形磁铁Ⅰ14和条形磁铁Ⅱ15的配合，可以确保在取用其他试剂的时候使避光槽仍处于避光的环境；通过PCR检测技术，根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度，与内参基因比对，可以推算出是否发生基因突变，并且可以对每份样本检测结果进行实时监控和评价，结果判定方式更加直观准确，同时具有操作步骤简单，单个样品检测成本相对低。

[0027] 用该试剂盒检测成骨不全致病基因COL1A1的具体方法 ：

[0028] 试剂主要组成：

[0029] （1）COL1A1基因rs72656353的引物

[0030] 上游引物 COL1A1-F；5' GCGTACACCACCGTTCA 3'

[0031] 下游引物 COL1A1-R；5' CTCAGAACTCTTCAGGCT 3'

[0032] (2) COL1A1基因rs72656353探针

[0033] 5' ACATGCAGAGCGTGACCA 3'

[0034] (3) 选取距COL1A1基因rs72656353位点10个碱基位置设计内参探针

[0035] 5' ATGCAGTCTGTCATGCTG 3'

[0036] (4)反应试剂：2×ddPCR Supermix

[0037] (5)反应试剂：微滴发生油

[0038] 步骤一：按照医疗常规操作采集孕妇外周血。使用EpiQuik Circulating Cell-Free DNA Isolation Kit提取血清中的cfDNA，样品cfDNA通过微定量仪测定，OD260/OD280的比值在1.7-2.0之间，基因组DNA浓度在10-20ng/μl为合格样品。

[0039] 步骤二：进行反应体系配制。

[0040] （1）数字PCR反应体系（总反应体系为20μl）及反应程序：

[0041] 反应体系：2×ddPCR Supermix ：10μl；COL1A1基因的引物混合物（包含COL1A1基因上游和下游引物）：2μl；探针混合物（包含COL1A1基因、内参基因）：2μl；样本DNA模板：40ng；去RNase与DNase水补足至20μl。在20μl混合物中加入70μl微滴发生油，使用微滴发生器QX200生成微滴，同时以去RNase与DNase作为模板，生成微滴，作为空白对照；取40μl微滴混合液移入qPCR管中，采用定量PCR仪进行定量PCR。

[0042] （2）反应程序：95℃变性8min；95℃变性30sec+60℃退火40sec，40个循环；98℃终变性10min。

[0043] 步骤三：定量PCR微滴信号检测

[0044] 采用微滴阅读器检测发光信号，使用QuantaSoft soreware软件计算阳性、阴性扩增的微滴个数，利用泊松分布计算目标片段起始浓度，拷贝数计算采用CNV=A/B*Na，公式计算。其中A代表靶基因的浓度，B代表内参基因的浓度，Na代表内参基因在基因组上的拷贝数。

[0045] 步骤五：结果分析：

[0046] （1）空白对照无检测结果。若有检测结果，说明实验操作过程中有污染，建议重新实验。

[0047] （2）当靶基因拷贝数与内参基因拷贝数一致，则说明胎儿及孕妇的COL1A1基因的致病位点rs72656353突变；当靶基因拷贝数：内参基因拷贝数为1：10-15，则说明胎儿的COL1A1的致病位点rs72656353突变；当靶基因没有检测结果，内参基因有检测结果时，说明胎儿COL1A1的致病位点rs72656353没有突变。

[0048] 数字PCR作为一种核酸分子绝对定量技术，根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与内参基因比对，可以推算出是否发生基因突变。并且可以对每份样本检测结果进行实时监控和评价，结果判定方式更加直观准确，同时具有操作步骤简单，单个样品检测成本相对低、无需开盖检测等诸多优势。本实用新型采用数字PCR检测操作更加简便，可以通过检测含量较低的孕妇外周血中的cfDNA，来检测胎儿的基因突变情况，并对检测结果进行实时监控和评价，而且结果判定方式更加简单直观，同时具有操作简便，相对单个样品成本较低等诸多优势。

[0049] 应理解，该实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。此外应理解，在阅读了本实用新型讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。