[0001] 本实用新型属于生物技术领域，尤其涉及鸡GADL1基因表达荧光定量RT‑PCR试剂盒，主要用于鸡GADL1基因表达调控肉品质和肌肉风味相关的功能研究。

[0002] 随着人民生活水平的提高，我国居民饮食消费观念也发生了转变，消费者不在只关注价格和重量，对肉类产品的口感和风味等方面有了更高的要求，因此消费者在购买肉产品时考虑的主要因素也发生着变化。鸡肉营养丰富、风味独特、价格低廉，是消费者最喜欢肉类之一，鸡肉的风味成为消费者关注和育种的重要目标。

[0003] 鸡肉品种间风味差异较大，主要集中在选育程度较低的地方品种和选育程度较高的引入品种白羽肉鸡之间，且研究认为地方品种鸡肉特性与引入品种鸡肉非常不同，因为它们脂肪含量低，质地坚韧，味道鲜美，地方品种鸡肉的风味普遍优于引入品种白羽肉鸡，因此地方品种越来越受到消费者的欢迎，消费者对生长缓慢的地方品种鸡肉类和肉制品的偏好较高，而培育品种中和了两者之间的优缺点或者在某一方面优点突出。

[0004] 鸡肉风味受相关基因的调控，GADL1是编码酸性氨基酸脱羧酶，可催化肌肉中天冬氨酸、半胱氨酸亚磺酸和半胱氨酸脱羧成为丙氨酸、次牛磺酸和牛磺酸等风味氨基酸。Mahootchi等研究表明GADL1敲除则出现β‑丙氨酸、肌肽和鹅肌肽的缺乏。章琳俐等用RNA‑seq技术对连城白鸭肉质风味形成相关基因进行挖掘，研究发现调控鲜味氨基酸形成的GADL1基因在连城白鸭胸肌高表达。由此可见，GADL1对肌肉的风味和肉品质具有重要的调控作用。
实用新型内容

[0005] 本实用新型的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种鸡GADL1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒，使用时，可以对容器进行夹持固定，不易造成容器的滑落，准确性高、快速、价格低廉，通过实时荧光定量RT‑PCR技术检测鸡GADL1基因表达，为研究鸡GADL1表达调控肌肉的风味和肉品质等研究奠定基础。

[0006] 本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一种鸡GADL1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒，包括盒体、翻盖以及置于盒体内的容器，其特征是：

[0008] 所述盒体内部由上而下设置：

[0009] 上衬垫层，具有若干上通孔，用于容器的导入；

[0010] 夹持结构，与上通孔数量一致且位置对应，用于夹持固定对应的容器；

[0011] 下衬垫层，具有若干下盲孔；所述下盲孔与上通孔数量一致且位置对应，用于支撑对应的容器底部。

[0012] 采用上述方案，将容器孔分解成三个部分，容器(可选择试管作为容器)由上通孔导入、夹持结构夹持其侧壁中部、下盲孔对其底部进行支撑，夹持结构可以避免试剂盒发生意外滑动，造成容器滑落、内部试剂溢出，影响检测效果的问题。

[0013] 进一步的，所述翻盖与盒体通过磁吸式锁扣盖合连接，使得试剂盒的打开、闭合更加快捷，进一步简化使用步骤。

[0014] 进一步的，所述上通孔的入口处呈喇叭口状，所述下盲孔的底部呈圆弧形，下盲孔的孔底处设有防滑缓冲垫。

[0015] 采用上述方案，上通孔的喇叭口状可以便于容器对准容器孔，便于容器的导入；下盲孔的圆弧形结构，与试管结构的容器更加匹配；下盲孔孔底缓冲垫的设置，可避免容器与下衬垫的硬性碰撞。上述结构均可对容器起到一定的保护作用，使用更加便捷。

[0016] 进一步的，每组夹持结构包括：

[0017] 支撑板，设有两块，且平行布置；每块支撑板表面沿其长度方向设有滑槽；

[0018] 滑块，设有四个，每块支撑板配备两个滑块；所述滑块底部设有导向柱，所述导向柱与对应支撑板的滑槽相匹配，滑块通过导向柱与对应支撑板的滑槽滑动配合，同一支撑板上的两个滑块之间通过拉伸弹簧相连；

[0019] 连接杆，设有两根，连接杆的两端分别连接两块支撑板上位置对应的两个滑块；

[0020] 夹板，设有两个，分别与两个连接杆中部连接，并相对布置；所述夹板的内侧壁设有橡胶防滑层，所述夹板的内侧壁上部设有斜面。

[0021] 采用上述方案，容器插入前，在拉伸弹簧力作用下，相对布置的两块夹板之间的距离小；容器插入时，克服拉伸弹簧力，同一支撑板上的两个滑块沿滑槽背向位移，两块夹板之间的距离变大，以便容器进入下盲孔；容器进入下盲孔后，在拉伸弹簧力作用下，同一支撑板上的两个滑块相靠近，继而通过相对布置的两夹板对容器进行夹持固定；取走容器后，在拉伸弹簧力作用下，同一支撑板上的两个滑块沿滑槽相向位移，最终复位。

[0022] 上述方案中，夹板的内侧壁上部设有斜面，可便于容器插入两块夹板之间；夹板的内侧壁设有橡胶防滑层，可避免与容器外壁发生硬性碰撞，对容器进行柔性保护。

[0023] 进一步的，所述盒体内分别具有放置SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物、鸡GADL1基因表达的特异性正反向引物、Rox染料、鸡内参基因newACTB表达的特异性正反向引物、灭菌DEPC水的容器。

[0024] 所述鸡GADL1基因表达的特异性正反向引物序列为：

[0025] F:5，—GAAGGCGAGATGGAGGCTAGT—3，

[0026] R:5，—AGCCTCTTCCACAAATTTCTCTCC—3；

[0027] 所述鸡内参基因newACTB表达的特异性正反向引物序列为：

[0028] F:5，—TTACTCCCACAGCCAGCCAT—3，

[0029] R:5,—AAACCGGCCTTGCACATACC—3。

[0030] 采用上述方案，通过实时荧光定量RT‑PCR技术检测鸡GADL1基因表达，为研究鸡GADL1表达调控肌肉的风味和肉品质等研究奠定基础。

[0031] 本实用新型GADL1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、自动化程度高，无污染、实时性好等优点。

[0039] 结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。

[0040] 实施例1

[0041] 一种鸡GADL1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒，包括盒体1、翻盖2以及置于盒体内的容器，所述盒体内部由上而下设置：

[0042] 上衬垫层3，具有若干上通孔4，用于容器(选择试管作为容器)的导入；

[0043] 夹持结构5，与上通孔数量一致且位置对应，用于夹持固定对应的容器；

[0044] 下衬垫层6，具有若干下盲孔7；下盲孔与上通孔数量一致且位置对应，用于支撑对应的容器底部。

[0045] 本实施例将容器孔8分解成三个部分，试管由上通孔导入、夹持结构夹持其侧壁中部、下盲孔对其底部进行支撑。

[0046] 如图1所示，翻盖与盒体通过磁吸式锁扣9盖合连接，使得试剂盒的打开、闭合更加快捷，简化使用步骤。

[0047] 如图2所示，上通孔的入口处呈喇叭口状，便于容器的导入；下盲孔的底部呈圆弧形，与试管结构的容器更加匹配；下盲孔孔底缓冲垫10的设置，可避免容器与下衬垫的硬性碰撞。

[0048] 盒体内分别具有放置SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物、鸡GADL1基因表达的特异性正反向引物、Rox染料、鸡内参基因newACTB表达的特异性正反向引物、灭菌DEPC水的容器。

[0049] 鸡GADL1基因表达的特异性正反向引物序列为：

[0050] F:5，—GAAGGCGAGATGGAGGCTAGT—3，

[0051] R:5，—AGCCTCTTCCACAAATTTCTCTCC—3；

[0052] 鸡内参基因newACTB表达的特异性正反向引物序列为：

[0053] F:5，—TTACTCCCACAGCCAGCCAT—3，

[0054] R:5,—AAACCGGCCTTGCACATACC—3。

[0055] 通过实时荧光定量RT‑PCR技术检测鸡GADL1基因表达，为研究鸡GADL1表达调控肌肉的风味和肉品质等研究奠定基础。

[0056] 实施例2

[0057] 如图3‑4所示，每组夹持结构包括：两块平行布置的支撑板11、四个滑块12、两根连接杆13以及相对布置的两个夹板14。每块支撑板表面沿其长度方向设有滑槽18，每块支撑板配备两个滑块；滑块底部设有导向柱15，导向柱与对应支撑板的滑槽相匹配，滑块通过导向柱与对应支撑板的滑槽滑动配合，同一支撑板上的两个滑块之间通过拉伸弹簧16相连。

[0058] 连接杆的两端分别连接两块支撑板上位置对应的两个滑块，两块夹板分别与两个连接杆中部连接。夹板的内侧壁设有橡胶防滑层17，夹板的内侧壁上部设有斜面。

[0059] 容器插入前，在拉伸弹簧力作用下，相对布置的两块夹板之间的距离小；容器插入时，克服拉伸弹簧力，同一支撑板上的两个滑块沿滑槽背向位移，两块夹板之间的距离变大，以便容器进入下盲孔；容器进入下盲孔后，在拉伸弹簧力作用下，同一支撑板上的两个滑块相靠近，继而通过相对布置的两夹板对容器进行夹持固定；取走容器后，在拉伸弹簧力作用下，同一支撑板上的两个滑块沿滑槽相向位移，最终复位。

[0060] 实施例3

[0061] GADL1基因在鸡不同类型肌肉中的表达比较

[0062] 以上市日龄的地方品种鸡(文昌鸡、鹿苑鸡)、培育品种鸡(817肉鸡、花山麻鸡)、引进白羽肉鸡(罗斯308)为素材，运用本实用新型对不同类型鸡胸肌的GADL1基因进行定量检测。

[0063] 文昌鸡、鹿苑鸡在17周龄，817肉鸡、花山麻鸡在12周龄，罗斯308在6周龄时采集胸肌组织样品置于液氮速冻后转入‑80℃冰箱保存；采用Trizol裂解法，从采集到的肌肉样本中提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照RT‑PCR试剂盒(Takara,Dalian,China)说明书反转录合成cDNA第一链。

[0064] 荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green I染料法，以上述合成的cDNA第一链为模板，设计的鸡GADL1基因表达的特异性正反向引物和鸡内参基因newACTB表达的特异性正反向引物，在Max3000P荧光定量PCR仪(爱普拜斯)上进行。即鸡各组织样本总RNA反转录成cDNA第一链后，分别配置GADL1和newACTB基因各自进行real‑time PCR扩增所需的反应体系，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。

[0065] 荧光定量PCR扩增体系配制见表1。

[0066] 表1荧光定量PCR扩增体系

[0067]

[0068] 将每个样本的2个基因的扩增体系同时放入荧光定量PCR仪，进行PCR反应，real time PCR扩增的反应条件设置如下：

[0069] 95℃预变性15min；然后40个循环的95℃变性30s,退火60℃30s,72℃30s；最后95℃30s,60℃30s,95℃30s。

[0070] 每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以newACTB基因为内参照，对GADL1基因mRNA表达水平进行校正，并采用2‑△△Ct法对数据进行处理，其中△Ct＝(CtGADL1基因‑CtnewACTB基因)，以一个品种，比如文昌鸡△Ct作为其他组织的参照，计算相对表达量△△Ct，△△Ct＝(△Ct(其他品种)–△Ct(文昌鸡)，以此来比较GADL1基因相对表达量，结果见图6。

[0071] 由图6可以看出，GADL1基因表达在不同类型鸡中表达量有一定的差异。文昌鸡、鹿苑鸡GADL1基因的表达显著高于其他品种(P≤0.05)。

[0072] 以上所述实施方式仅表达了本实用新型的一种或多种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。

[0073] 本实用新型用实时荧光定量RT‑PCR技术检测鸡GADL1基因表达的方法，为研究鸡GADL1基因表达调控以及肌肉品质及风味等至关重要。