技术领域
[0001] 本实用新型涉及病原微生物检测领域，具体地说，涉及一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒。
相关背景技术
[0002] 毛霉菌又名黑霉或长毛霉，为腐生性真菌，具有蛋白质分解能力，常引起食物霉变。其普遍发现于土壤、粪便、禾草及空气等环境中，以孢囊孢子和接合孢子等形式繁殖，是一种条件致病性真菌，在人体免疫力低下时可能会引起人体致毛霉菌病 。一般来说，毛霉菌病症状首先发生在鼻和耳部，随着毛霉菌通过鼻腔和呼吸道进入患者体内，会引起颌窦和眼眶的坏死性炎症和肉芽肿；一旦毛霉菌经血流侵人脑部，引起脑膜炎；与此同时，毛霉菌还可能扩散至肺、胃肠道等。但是，由于毛霉病发病急，病情进展快，诊断困难，所以死亡率高。
[0003] 目前，毛霉菌病的一般临床检测方法有痰培养、病理活检、影像学检测。但是，由于检出率和特异性均不高，极易误诊为其他病原体导致的感染，因此不足以在毛霉菌病及时精确诊断、毛霉菌病暴发和感染溯源等辅助诊断方面做出快速反应。鉴于这些因素，迫切需要开发辅助毛霉菌病快速诊断的产品。
[0004] 因为具有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强等优点，所以PCR检测技术的产品在微生物检测方面应用较为普遍。但是，传统PCR技术是一个基于终点的检测，只能进行定性或半定量的分析；而，实时荧光定量PCR需要标准曲线来进行定量分析。以上这些在一定程度上限制了基于PCR检测技术的产品在毛霉菌病及时精确诊断、毛霉菌病暴发和感染溯源等方面的应用。而，数字PCR是通过根据荧光信号的有无来进行绝对定量的第三代PCR技术，具有反应体系中抑制剂影响小，背景序列浓度干扰低和无需制作标准曲线的优点。因此，基于数字PCR技术的产品有望促进，拓展和改善PCR检测技术在毛霉菌病及时精确诊断、毛霉菌病暴发和感染溯源等辅助诊断方面的应用。
[0005] 基于此，为了辅助毛霉菌病的及时精确诊断，保障毛霉菌病暴发和感染溯源工作的顺利开展，本实用新型申请人公开了一种毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒。实用新型内容
[0006] 本实用新型要解决的技术问题在于克服毛霉菌病现有辅助诊断技术的不足，提供一种可以克服上述问题或者部分地解决上述问题的一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，为毛霉菌病的及时精确诊断，保障毛霉菌病暴发和感染溯源工作的顺利开展提供有力保障。
[0007] 为了达到上述目的，本实用新型的技术方案是：
[0008] 一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，包括盒体和盒盖，盒体内设有用于检测毛霉菌的液滴数字PCR反应液和质控品，所述液滴数字PCR反应液中含有用于检测毛霉菌的特异性正反向引物和探针，所述探针两端标记有荧光基团。
[0009] 进一步地，用于检测毛霉菌的特异性正反向引物和探针和探针序列包括：
[0010] 1）针对米根霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 1所示，反向引物序列如SEQ ID 2所示，所述探针序列如SEQ ID 3所示；
[0011] 正向引物：5´‑TCAGTGACGCGATTTTAGAGATG‑3´ SEQ ID 1,
[0012] 反向引物：5´‑GAATGACCTATGACGCTATATAG‑3´ SEQ ID 2,
[0013] 检测探针：5´‑TAACAACAGCGTCCGCTACTGCA‑3´ SEQ ID 3；
[0014] 2）针对微小根毛霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 4所示，反向引物序列如SEQ ID 5所示，所述探针序列如SEQ ID 6所示：
[0015] 正向引物：5´‑TGTAAGACCGCAGACGCGTCC‑3´ SEQ ID 4,
[0016] 反向引物：5´‑GAGTGACGCGATTTAGAGAAG‑3´ SEQ ID 5,
[0017] 检测探针：5´‑TGGACCGTCCACATTACCGTA‑3´ SEQ ID 6；
[0018] 3）针对伞枝横梗霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 7所示，反向引物序列如SEQ ID 8所示，所述探针序列如SEQ ID 9所示：
[0019] 正向引物：5´‑GGTTTATACACGCCCTGTCCA‑3´SEQ ID 7,
[0020] 反向引物：5´‑CCAGTCTTGTGGGCCAGTGGAT‑3´SEQ ID 8,
[0021] 检测探针：5´‑GCAGTCTTGTAACCAGTGAGC‑3´SEQ ID 9；
[0022] 进一步地，所述探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’标记有荧光淬灭基团，所述荧光报告基团光谱范围不同。
[0023] 优选地，所述SEQ ID 3所示核苷酸序列的5’端标记有Cy5，3’标记有BHQ2；
[0024] 所述SEQ ID 6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’标记有BHQ1；
[0025] 所述SEQ ID 9所示核苷酸序列的5’端标记有HEX，3’标记有Eclipse。
[0026] 优选地，所述液滴数字PCR反应液中包括5×PerfeCTaMultiPlexq PCR ToughMix、1微摩尔每升Fluorescein sodium salt、所述6种25微摩尔每升正反向引物、所述3种25微摩尔每升探针。
[0027] 优选地，质控品包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为无菌水，阳性质控品为米根霉DNA溶液, 微小根毛霉DNA溶液和伞枝横梗霉的DNA溶液。
[0028] 进一步地，所述试剂盒还包括盒盖，所述盒盖与盒体铰连连接。
[0029] 进一步地，所述盒体内设有若干个圆桶状容纳腔，所述容纳腔设置为能容纳装有液滴数字PCR反应液，包括用于检测毛霉菌的特异性正反向引物，探针，阴性质控品(灭菌无核酸酶水)，阳性质控品（米根霉DNA溶液, 微小根毛霉DNA溶液和伞枝横梗霉的DNA溶液）的试剂管。
[0030] 进一步地，所述容纳腔的内径与所述试剂管的外径一致；所述容纳腔的壁厚为1‑2cm。
[0031] 进一步地，所述容纳腔包括容纳腔盖，所述容纳腔盖与所述容纳腔腔口左边外壁和左边内壁的中间通过铰连结构固定连接，所述容纳腔盖上设置有锁扣，所述锁扣与所述容纳腔腔口右边外壁和右边内壁的中间设置的锁栓以卡扣结构形式配套使用。
[0032] 一种利用所述多重液滴数字PCR试剂盒检测毛霉菌的方法，该方法包括以下步骤：第一步，对样品进行处理并提取DNA，得到样品处理液；第二步，打开所述试剂盒的盒盖和容纳腔盖，取出装有所述液滴数字PCR反应溶液的试剂管，配制液滴数字PCR反应溶液，将其与第一步中所获得的样品处理液进行混合，获得液滴数字PCR反应混合液；第三步，将第二步中所获得的液滴数字PCR反应混合液加入数字PCR芯片中，置于液滴生成和扩增系统，在生成液滴后进行PCR扩增反应；第四步，将在第三步中完成扩增的数字PCR芯片置于荧光读取仪中，利用软件进行结果读取和分析。
[0033] 优选地，所述液滴数字PCR反应溶液与所述样品处理液混合的体积比为10:1。
[0034] 优选地，所述样品处理液中DNA的浓度范围为1×10‑2 ‑1×10‑3 纳克每微升。
[0035] 优选地，所述液滴数字 PCR反应混合液的体积为25微升，其包括5微升5×PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix、2微升1微摩尔每升的Fluorescein sodium salt、6种各1微升的浓度为20微摩尔每升的上下游引物、3种各0.2微升的浓度为20微摩尔每升的探针、2微升样品 DNA和无菌水。
[0036] 优选地，所述PCR扩增反应的条件为：先在90摄氏度预变性10分钟；随后在以下条件下：90摄氏度放置30秒、50摄氏度放置60秒，进行45个循环。
[0037] 与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
[0038] 第一，本实用新型所述试剂盒能够对毛霉菌进行绝对定量，直接检测出样品中的拷贝数，相对于荧光定量PCR，不需要建立标准曲线，使检测流程更为简便；
[0039] 第二，本实用新型所述试剂盒能够通过分液增加PCR扩增效率，提高PCR反应对抑制剂的耐受程度，让抗干扰性增强，减少了检测的假阴性率，有效提高了毛霉菌检测灵敏度；
[0040] 第三，本实用新型所述试剂盒采用三对引物和探针能够对不同类型的毛霉菌进行检测，检测特异性高，减少了检测的假阳性率；
[0041] 第四，本实用新型所述试剂盒在容纳腔顶端设置有容纳腔盖，所述容纳腔盖通过锁扣与锁栓的配套使用可防止试剂管在容纳腔内随意移动，保证运输安全。
具体实施方式
[0045] 以下将参考附图并结合实施例来详细说明本实用新型。需要说明的是，在不冲突的情况下，本实用新型中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。为叙述方便，下文中如出现“上”、“下”、“左”、“右”字样，仅表示与附图本身的上、下、左、右方向一致，并不对结构起限定作用。本实用新型的实施例仅仅是为了解释本实用新型，并非为了限制本实用新型，且本实用新型的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件制作，或按材料供应商推荐的条件制作。此外应理解，本实用新型中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后 还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本实用新型中提到的组合连接关系并不排斥在所述组合前后还可以存在其他连接或在这些明确提到的两个连接之间还可以插入其他连接，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本实用新型可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本实用新型可实施的范畴。在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。
[0046] 本实用新型的盒体1，盒盖2，容纳腔3‑17，容纳腔盖18，铰连结构19，锁扣20和锁栓21部件均为通用标准件或本领域技术人员知晓的部件，其结构和原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知。
[0047] 实施例1
[0048] 如附图1和附图2所示，一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒，包括盒体1和与盒体1铰链连接的盒盖2，盒体1内设有放置5×PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix试剂管的容纳腔3、放置Fluorescein sodium salt试剂管的容纳腔4、放置米根霉特异性正向引物试剂管的容纳腔5、放置米根霉特异性反向引物试剂管的容纳腔6、放置米根霉特异性探针试剂管的容纳腔7、放置微小根毛霉特异性正向引物试剂管的容纳腔8、放置微小根毛霉特异性反向引物试剂管的容纳腔9、放置微小根毛霉特异性探针试剂管的容纳腔10、放置伞枝横梗霉特异性正向引物试剂管的容纳腔11、放置伞枝横梗霉特异性反向引物试剂管的容纳腔12、放置伞枝横梗霉特异性探针试剂管的容纳腔13、放置无菌水试剂管的容纳腔14、放置米根霉阳性质控品的容纳腔15、放置微小根毛霉阳性质控品的容纳腔16、放置伞枝横梗霉阳性质控品的容纳腔17；
[0049] 其中，针对米根霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 1所示，反向引物序列如SEQ ID 2所示，所述探针序列如SEQ ID 3所示；
[0050] 正向引物：5´‑TCAGTGACGCGATTTTAGAGATG‑3´ SEQ ID 1,
[0051] 反向引物：5´‑GAATGACCTATGACGCTATATAG‑3´ SEQ ID 2,
[0052] 检测探针：5´‑TAACAACAGCGTCCGCTACTGCA‑3´ SEQ ID 3；
[0053] 其中，针对微小根毛霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 4所示，反向引物序列如SEQ ID 5所示，所述探针序列如SEQ ID 6所示：
[0054] 正向引物：5´‑TGTAAGACCGCAGACGCGTCC‑3´ SEQ ID 4,
[0055] 反向引物：5´‑GAGTGACGCGATTTAGAGAAG‑3´ SEQ ID 5,
[0056] 检测探针：5´‑TGGACCGTCCACATTACCGTA‑3´ SEQ ID 6；
[0057] 其中，针对伞枝横梗霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 7所示，反向引物序列如SEQ ID 8所示，所述探针序列如SEQ ID 9所示：
[0058] 正向引物：5´‑GGTTTATACACGCCCTGTCCA‑3´SEQ ID 7,
[0059] 反向引物：5´‑CCAGTCTTGTGGGCCAGTGGAT‑3´SEQ ID 8,
[0060] 检测探针：5´‑GCAGTCTTGTAACCAGTGAGC‑3´SEQ ID 9；
[0061] 其中，所述SEQ ID 3所示核苷酸序列的5’端标记有Cy5，3’标记有BHQ2；所述SEQ ID 6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’标记有BHQ1；所述SEQ ID 9所示核苷酸序列的5’端标记有HEX，3’标记有Eclipse；
[0062] 进一步地，如附图3所示，所述每个容纳腔的壁厚为2cm；所述每个容纳腔腔口左边外壁和左边内壁的中间设有固定连接容纳腔盖18的铰连结构19，所述每个容纳腔盖18上设置有锁扣20，所述容纳腔腔口右边外壁和右边内壁的中间设置有与所述容纳腔盖18的锁扣20以卡扣结构形式配套使用的锁栓21，以便每个容纳腔可以对放置的试剂管进行移动限制，保证运输安全。
[0063] 实施例2
[0064] 一种检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒的使用方法，包括以下主要步骤：
[0065] 第一步，使用商用基因组DNA提取试剂盒并按说明提取米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、曲霉菌、新型隐球菌、白色念珠菌的模板DNA。如不能及时检验，提取的DNA可于‑20摄氏度保存；
[0066] 第二步，配制多重液滴数字PCR扩增体系：扩增体系总体积为25微升，其包括5微升5×PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix、2微升1微摩尔每升的Fluorescein sodium salt、6种各1微升的浓度为20微摩尔每升的上下游引物、3种各0.2微升的浓度为20微摩尔每升的探针、2微升样品 DNA和无菌水；
[0067] 其中，针对米根霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 1所示，反向引物序列如SEQ ID 2所示，所述探针序列如SEQ ID 3所示；
[0068] 正向引物：5´‑TCAGTGACGCGATTTTAGAGATG‑3´ SEQ ID 1,
[0069] 反向引物：5´‑GAATGACCTATGACGCTATATAG‑3´ SEQ ID 2,
[0070] 检测探针：5´‑TAACAACAGCGTCCGCTACTGCA‑3´ SEQ ID 3；
[0071] 其中，针对微小根毛霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 4所示，反向引物序列如SEQ ID 5所示，所述探针序列如SEQ ID 6所示：
[0072] 正向引物：5´‑TGTAAGACCGCAGACGCGTCC‑3´ SEQ ID 4,
[0073] 反向引物：5´‑GAGTGACGCGATTTAGAGAAG‑3´ SEQ ID 5,
[0074] 检测探针：5´‑TGGACCGTCCACATTACCGTA‑3´ SEQ ID 6；
[0075] 其中，针对伞枝横梗霉核酸序列设计的正向引物序列如SEQ ID 7所示，反向引物序列如SEQ ID 8所示，所述探针序列如SEQ ID 9所示：
[0076] 正向引物：5´‑GGTTTATACACGCCCTGTCCA‑3´SEQ ID 7,
[0077] 反向引物：5´‑CCAGTCTTGTGGGCCAGTGGAT‑3´SEQ ID 8,
[0078] 检测探针：5´‑GCAGTCTTGTAACCAGTGAGC‑3´SEQ ID 9；
[0079] 其中，所述SEQ ID 3所示核苷酸序列的5’端标记有Cy5，3’标记有BHQ2；所述SEQ ID 6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’标记有BHQ1；所述SEQ ID 9所示核苷酸序列的5’端标记有HEX，3’标记有Eclipse；
[0080] 第三步，将数字PCR芯片平稳地放于实验台上，切勿震动，打开进样口塞子，于数字PCR芯片孔井中小心注入25微升液滴数字PCR反应液以免产生气泡，静置3分钟后； 打开微滴生成扩增系统和气压泵开关，气压泵输出压力和微滴生成扩增系统输入压力都设置为1000±50毫巴；
[0081] 第四步，将数字PCR芯片轻轻地放置于加热模块上，盖上机器盖，设置PCR反应参数为：先在90摄氏度预变性10分钟；随后在以下条件下：90摄氏度放置30秒、50摄氏度放置60秒，进行45个循环；
[0082] 第五步，将数字PCR芯片置于微滴读取分析系统，分析液滴图确定荧光阈值，读取阳性与阴性液滴计数。
[0083] 实施例3
[0084] 对本实用新型多重液滴数字PCR试剂盒检测毛霉菌的特异性评价，具体如下：
[0085] 用本实用新型的试剂盒分别对米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、曲霉菌、新型隐球菌和白色念珠菌进行液滴数字PCR检测，以无菌水作为空白对照来验证本实用新型试剂盒检测毛霉菌的特异性。实验结果显示每个样品生成的液滴数量大于20000，符合泊松分布计算的需要，此外，在无菌水中没有观察到阳性扩增，说明体系没有受到污染。进一步地，实验结果显示米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉均有明显地阳性扩增，而曲霉菌、新型隐球菌和白色念珠菌没有任何地扩增。这些表明本实用新型试剂盒的多重液滴数字PCR体系的引物及探针特异性良好，可以用于很好地特异性扩增毛霉菌菌，同时能够分辨曲霉菌、新型隐球菌和白色念珠菌。
[0086] 实施例4
[0087] 对本实用新型多重液滴数字PCR试剂盒检测毛霉菌的试剂盒的灵敏度评价，具体如下：
[0088] 将米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉的DNA模板按照1：1的比例混合制成50纳克每‑2 ‑3 ‑4 ‑5微升的DNA混合模板。将混合模板进行十倍浓度梯度稀释，分别稀释成10 、10 、10 、10 、‑6 ‑7 ‑8
10 、10 和10 共7个梯度，以无菌水作为阴性对照，并用本实用新型的试剂盒进行多重液滴数字PCR检测和灵敏度实验。实验结果表明，可以观察到米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉都有阳性液滴产生，同时阳性液滴和阴性液滴界限清晰，液滴生成数量达到实验要求。随着‑8
模板DNA浓度的降低，阳性液滴数减少，当模板浓度低至10 时仍然可以见到阳性液滴，说明本实用新型多重液滴数字PCR试剂盒检测毛霉菌基因组DNA的灵敏度为5飞克每微升。
[0089] 实施例5
[0090] 本实用新型实例1中检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒对试样检测结果与商用PCR试剂盒对毛霉菌的检测结果非常一致，但本实用新型相比商用PCR试剂盒检测样本所需的操作时间缩短了20分钟，大大提高了检测过程效率。此外，本实用新型相比PCR试剂盒样本检出准确率提高了5.1%，达到了100%。
[0091] 实施例6
[0092] 本实用新型实例1中检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒对毛霉菌病临床样本的检测结果与商用PCR试剂盒的检测结果非常一致，但本实用新型相比商用PCR试剂盒检测样本所需的操作时间缩短了30分钟，大大提高了检测过程效率。此外，本实用新型相比PCR试剂盒对临床样本检出准确率提高了15%，达到了100%。
[0093] 实施例7
[0094] 本实用新型实例1中检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒对所采集的伤口拭子、血浆、脑脊液、骨髓液、房水、胸腹水、关节积液、组织、尿液、脓肿抽液、肺泡灌洗液、痰液或鼻咽拭子等样本按临床检验检测标准操作流程处理后进行检测，结果表明实施例1中检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒的检测结果均能准确地反应样本的真实情况。与商品化PCR试剂盒比较，实施例1检测毛霉菌的多重液滴数字PCR试剂盒不仅检出准确率高达100%，而且检测时间短。按成本价计算，每个样本的检测费平均节省12元，不仅利于医院医保的采购使用，而且能给检测者节省一笔检测费用。
[0095] 上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本实用新型，而不用于限制本实用新型的范围，在阅读了本实用新型之后，本领域技术人员对本实施例的各种等价形式的修改均落入本实用新型所附权利要求所限定的范围。
