技术领域
[0001] 本实用新型涉及真菌鉴定领域，尤其一种鉴定药品质量控制中常见产毒真菌的试剂盒。
相关背景技术
[0002] 医药产业发展迅速，相关产品发生微生物污染的事件也在增加，污染微生物不仅包括细菌也包括真菌，其中部分真菌还会产生毒性强烈的真菌毒素，因此一旦发生真菌污染尤其是产毒真菌污染会对药品质量以及患者的用药安全造成极大风险。因此药品生产和检验过程中分离的致病菌需被准确鉴定。相对于细菌，真菌形态简单，传统的形态鉴定难度大。采用分子生物学方法对真菌进行鉴定，结果将更加准确。利用特征核酸片段进行分子鉴定已成为分子生物学研究的热点，该技术通过选择一段公认、易扩增、且相对较短的DNA片断，以核酸测序技术为基础，以不同微生物核酸序列的差异实现对微生物进行经济、快捷、准确的鉴定。
[0003] 现有特征序列的鉴定方法的研究主要对真菌的某一个属或特定某一类别进行鉴定，特征序列的种类比较多且繁杂，尚无针对药品领域常见产毒真菌的系统特征序列进行鉴定的试剂盒。但目前的试剂盒只能作为一个储存装置，在运输过程或者在被携带过程中，不能对里面的试剂进行低温储藏。
[0004] 为了实现对药材中产毒真菌的快速准确鉴定和真菌毒素的早期风险预警，需要能够放置鉴定药品质量控制中常见产毒真菌试剂且可以低温运输的试剂盒。实用新型内容
[0005] 本实用新型为解决现有技术中的上述问题，提出了一种鉴定药品质量控制中常见产毒真菌的试剂盒，采用的两种特征序列广谱性好，既可以分别进行鉴定而且可以联合使用，不必要研究更换其他特征序列，且试剂盒操作简单，适用于药品质量控制中常见的所有产毒真菌鉴定，适用性强。
[0006] 为实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案：
[0007] 本实用新型的第一个方面是提供一种鉴定药品质量控制中常见产毒真菌的试剂盒，包括盒盖、上盒体、中盒体和下盒体；其中，上盒体为可以放置冰袋的空腔；中盒体为抽屉结构，设置有核酸提取试剂存放腔、PCR反应体系存放腔、PCR产物纯化试剂存放腔，每个腔均包含固定板；下盒体为放置冰袋的抽屉结构。
[0008] 进一步地，中盒体和下盒体的开口方向相邻。
[0009] 进一步地，核酸提取试剂存放腔内设置多个试管；该试管至少包括CTAB缓冲液管、2-巯基乙醇管和TE缓冲液管。
[0010] 进一步地，PCR反应体系存放腔设置多个试管；该试管至少包括引物管、DNA聚合酶管、PCR缓冲液管和脱氧核糖核苷三磷酸试管。
[0011] 进一步地，引物管为多个，分别含有特征序列ITS和LSU的正向、反向扩增引物。
[0012] 进一步地，ITS特征序列的扩增引物序列如下所示；
[0013] 正向引物(ITS 5F)：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；
[0014] 反向引物(ITS 4R)：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
[0015] 进一步地，LSU特征序列的扩增引物序列如下所示；
[0016] 正向引物(LSU F)：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′；
[0017] 反向引物(LSU R)：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′。
[0018] 进一步地，PCR产物纯化试剂存放腔内设置多个试管；该试管至少包括TE缓冲液管、乙酸钠溶液管和乙二胺四乙酸二钠溶液管。
[0019] 进一步地，中盒体还包括卡扣和卡座；其中，卡座固定在上盒体和中盒体分隔处的盒体外侧，卡扣固定在中盒体的抽屉结构正面的上缘，与卡座适配。
[0020] 进一步地，上盒体的四周外缘还可以设置把手。
[0021] 进一步地，固定板上有和试管大小适配的孔。
[0022] 进一步地，下盒体也包括卡扣和卡座，设置于盒体的外侧。
[0023] 本实用新型的第二方面是提供采用上述试剂盒来鉴定药品质量控制中常见产毒真菌的方法，包括如下步骤：
[0024] 步骤一，对菌株进行分离纯化；
[0025] 步骤二，提取核酸：取菌体置于离心管中，研磨，然后加入CTAB缓冲液和2-巯基乙醇；水浴0.5-1.5h，然后加入饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置；室温离心，取上清液置于新的离心管中；若上清液混浊，可再加入等体积饱和苯酚-氯仿-异戊醇溶液，室温离心，取上清液置于新的离心管中；再加入等体积的异丙醇溶液，颠倒使之充分混匀，室温放置2～3分钟，室温离心，弃上清；漂洗并风干加入TE缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液(模板DNA)，置4℃冰箱中备用。
[0026] 步骤三，扩增特征序列；
[0027] 步骤四，检测核酸扩增产物：采用琼脂糖凝胶电泳法检测核酸扩增产物；
[0028] 步骤五，纯化核酸扩增产物：将步骤四中获得的琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，置于离心管中，加入TE缓冲液，水浴至凝胶块完全溶解；分别加入乙酸钠溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液，混匀；加入无水乙醇，静置；离心，弃去上清液；加入适量75％乙醇(v/v)溶液洗涤，离心，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入50～200μl的TE缓冲溶液溶解，作为核酸扩增产物的纯化溶液，置4℃冰箱中备用；
[0029] 步骤六，对核酸进行测序和比对分析序列：以步骤五获得的扩增引物作为测序引物，使用核酸测序仪对纯化后的核酸扩增产物进行双向测序，获得目标核酸序列，双向测序峰图采用有峰图拼接功能的软件，以正、反向核酸序列叠加的方式进行序列拼接，并去除两端引物区序列；将获得的真菌DNA特征序列进行比对分析，得到判定结果。
[0030] 进一步地，步骤二中的苯酚-氯仿-异戊醇溶液中的苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1。
[0031] 进一步地，步骤二中离心所采用的转速为每分钟12000转。
[0032] 进一步地，步骤三中的扩增体系包括：PCR反应缓冲液2.5μl，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs，2.5mmol/L)2μl，正向和反向引物(2.5μmol/L)各2μl，模板DNA 1μl，Taq DNA聚合酶(1U/μl)1μl，加灭菌的纯化水至25μl。
[0033] 进一步地，步骤三中的扩增程序为94℃预变性10分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，29个循环；72℃继续延伸5分钟。
[0034] 进一步地，步骤四中采用的琼脂糖凝胶中加入的核酸凝胶染色剂为溴化乙锭或吖啶橙。
[0035] 本实用新型采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0036] 本实用新型提供的一种鉴定药品质量控制中常见产毒真菌的试剂盒设计巧妙，可以在运输的过程中有效地保持低温；此外，本试剂盒采用的特征序列长度适中、通用性好、区分度强、准确度高，能有效区分真菌在“属”或“种”水平的序列差异。
具体实施方式
[0039] 本实用新型提供了一种鉴定药品质量控制中常见产毒真菌的试剂盒。
[0040] 下面通过具体实施例对本实用新型进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本实用新型，但是下述实施例并不限制本实用新型范围。
[0041] 实施例一
[0042] 如图1、图2所示，本实施例提供一种鉴定药品质量控制中常见产毒真菌的试剂盒，包括盒盖1、上盒体2、中盒体3和下盒体4；其中，上盒体2为可以放置冰袋的空腔；中盒体3为抽屉结构，设置有核酸提取试剂存放腔31、PCR反应体系存放腔32、PCR产物纯化试剂存放腔33，每个腔均包含固定板5；下盒体4为放置冰袋的抽屉结构。其中：
[0043] 上述中盒体3和下盒体4的开口方向相邻，使得使用起来方便。
[0044] 上述核酸提取试剂存放腔31内设置多个试管；该试管至少包括CTAB缓冲液管、2-巯基乙醇管和TE缓冲液管。
[0045] 上述PCR反应体系存放腔32设置多个试管；该试管至少包括引物管、DNA聚合酶管、PCR缓冲液管和脱氧核糖核苷三磷酸试管。引物管为多个，分别含有特征序列ITS和LSU的正向、反向扩增引物。
[0046] ITS特征序列的扩增引物序列如下所示；
[0047] 正向引物(ITS 5F)：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；
[0048] 反向引物(ITS 4R)：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
[0049] LSU特征序列的扩增引物序列如下所示；
[0050] 正向引物(LSU F)：5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′；
[0051] 反向引物(LSU R)：5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′。
[0052] 上述PCR产物纯化试剂存放腔33内设置多个试管；该试管至少包括TE缓冲液管、乙酸钠溶液管和乙二胺四乙酸二钠溶液管。
[0053] 上述中盒体3还包括卡扣34和卡座35；其中，卡座35固定在上盒体2和中盒体3分隔处的盒体外侧，卡扣34固定在中盒体3的抽屉结构正面的上缘，与卡座35适配。同样地，下盒体也包括卡扣和卡座，设置于盒体的外侧，便于运输。
[0054] 上述上盒体2的四周外缘还可以设置把手，方便携带。
[0055] 上述固定板5上有和试管大小适配的孔，使得试管固定牢靠。
[0056] 实施例二
[0057] 本实施例提供采用实施例一中的试剂盒来鉴定药品质量控制中常见产毒真菌的方法，包括如下步骤：
[0058] 步骤一、菌株的分离纯化
[0059] 将适宜的固体培养基平板倒转，用接种环取待检菌菌体或其供试液，向上接种1～3点，然后正置平板培养。
[0060] 步骤二、核酸提取
[0061] 取约20mg菌体置于离心管中，研磨，然后加入400μl的CTAB缓冲液和4μl2-巯基乙醇；65℃水浴1h，水浴期间每隔10分钟，震荡1次；加入200μl饱和苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1，v/v/v)溶液，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5分钟；室温离心(转速为每分钟12000转)5分钟，取上清液置于新的离心管中；若上清液混浊，可再加入等体积饱和苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1，v/v/v)溶液，室温离心(转速为每分钟12000转)5分钟，取上清液置于新的离心管中；再加入等体积的异丙醇溶液，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3分钟，室温离心(转速为每分钟12000转)5分钟，弃上清；加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1～3分钟，室温离心(转速为每分钟12000转)2分钟，弃上清，重复操作1次；室温风干至残留的乙醇完全挥发；加入50～200μl的TE缓冲液，混匀后作为核酸提取溶液(模板DNA)，置4℃冰箱中备用。
[0062] 步骤三、特征序列的扩增
[0063] 1.扩增引物
[0064] 正向引物(ITS 5F):5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′；
[0065] 反向引物(ITS 4R):5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
[0066] 或/和
[0067] 正向引物(LSU F):5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′；
[0068] 反向引物(LSU R):5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′。
[0069] 2.PCR反应体系为25μl：取PCR反应缓冲液2.5μl，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs，2.5mmol/L)2μl，正向和反向引物(2.5μmol/L)各2μl，模板DNA1μl，Taq DNA聚合酶(1U/μl)1μl，加灭菌的纯化水至25μl。
[0070] 3.采用的扩增程序为：94℃预变性10分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，29个循环；72℃继续延伸5分钟。
[0071] 步骤四、核酸扩增产物的检测
[0072] 采用琼脂糖凝胶电泳法检测核酸扩增产物。使用电泳缓冲液配制1.5％琼脂糖凝胶，其中加入溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)、吖啶橙(Acridine orange,AO)等适宜的核酸凝胶染色剂。取核酸扩增产物5μl、上样缓冲液1μl，混匀后上样，于100～150V电压下电泳，溴酚蓝条带移动至凝胶片的1/2～2/3处结束电泳。取凝胶片在紫外凝胶成像仪上检视，核酸扩增产物应在约500～800bp的位置出现一条目的条带。核酸扩增产物检测时应选择适宜的DNA分子量标记(Marker)，目的条带的大小应包括在Marker的范围内。
[0073] 步骤五、核酸扩增产物的纯化
[0074] 将琼脂糖凝胶中的核酸扩增产物切下，置于离心管中，加入适量体积的TE缓冲液，水浴至凝胶块完全溶解；分别加入1/10体积乙酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和乙二胺四乙酸二钠溶液(125mmol/L，pH 8.0)，混匀；加入2倍体积无水乙醇，-20℃静置30分钟；离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液；加入适量75％乙醇(v/v)溶液洗涤，离心(转速为每分钟12000转)10分钟，弃去上清液，室温风干至乙醇挥发完全；加入50～100μl的TE缓冲溶液溶解，作为核酸扩增产物的纯化溶液，置4℃冰箱中备用。
[0075] 步骤六、核酸测序与序列比对分析
[0076] 以扩增引物作为测序引物，使用核酸测序仪对纯化后的核酸扩增产物进行双向测序，获得目标核酸序列。双向测序峰图采用有峰图拼接功能的软件，以正、反向核酸序列叠加的方式进行序列拼接，并去除两端引物区序列。拼接后得到的核酸序列方向与核酸扩增正向引物方向一致。将获得的真菌DNA特征序列进行比对分析，得到判定结果。
[0077] 以上对本实用新型的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本实用新型并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本实用新型进行的等同修改和替代也都在本实用新型的范畴之中。因此，在不脱离本实用新型的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本实用新型的范围内。
