技术领域
[0001] 本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸡脂肪酸分解代谢相关的LPL基因荧光定量RT-PCR试剂盒。
相关背景技术
[0002] 目前，脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase，LPL)分别是脂肪酸分解过程中的关键酶，对肌内脂肪沉积有着非常重要的影响。LPL能够将血液中乳糜微粒和极低密度脂蛋白所携带的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，向有关组织提供合成甘油三酯所需的原料，对脂肪沉积起着重要的调控作用。研究LPL基因的表达调控对于了解肉鸡机内脂肪积规律和脂质代谢调控机理具有重要意义。
[0003] 此外，现有的关于LPL基因的试剂盒很少，并且常见的试剂盒结构都较为简单，出于检测的需要，检测人员往往需要便捷地、快速地打开试剂盒，然后再取出试剂瓶，如果检测人员取出试剂瓶速度过慢，很有可能会影响检测结果，而且如果检测人员提前取出试剂瓶，也会对检测结果造成影响。实用新型内容
[0004] 为了解决上述问题，本实用新型的目的是公开一种鸡脂肪酸分解代谢相关的LPL基因荧光定量RT-PCR试剂盒，是操作人员利用伸缩组件将盛装试剂瓶的垫板从下向上拉出，以使得试剂瓶高出试剂盒体，进而便于操作人员便捷地、快速地取出试剂瓶。
[0005] 本实用新型是通过以下技术方案实现的：一种鸡脂肪酸分解代谢相关的LPL基因荧光定量RT-PCR试剂盒，包括盒体和盖体，所述盒体内设置有盛装试剂瓶的垫板，所述垫板通过滑动件与盒体内壁连接；所述盖体的内壁固接有升降垫板的伸缩组件。
[0006] 进一步地，所述垫板的下方设置有防止试剂瓶倾斜的海绵垫，所述海绵垫对应垫板的盛装孔开设有放置试剂瓶的放置孔。
[0007] 进一步地，所述滑动件为开设于盒体内侧的导轨、沿垫板水平向外突出的滑块，且所述滑块在导轨内滑动。
[0008] 进一步地，所述伸缩组件为自锁式伸缩杆，所述自锁式伸缩杆的一端固接于垫板，其另一端固接于盖体内壁。
[0009] 进一步地，所述自锁式伸缩杆包括长杆A和短杆B，长杆A的直径＜短杆B的直径；其中长杆A的一端与垫板固接，其另一端贯穿盒体与短杆 B通过自锁组件固接于一体，且所述短杆B的长度等于盖体的厚度，长杆 A的长度等于盒体的深度。
[0010] 进一步地，所述盛装孔的直径大小依次为盛装孔A<盛装孔B<盛装孔 C<盛装孔D<盛装孔E。
[0011] 进一步地，所述试剂瓶包括盛装SYBR Green Master热启动荧光PCR 混合物的试剂瓶A、盛装鸡LPL基因表达的特异性正反向引物试剂瓶B、盛装鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物的试剂瓶C、盛装dNTP 的试剂瓶D、盛装灭菌DEPC水的试剂瓶E；其中，鸡CPT1B基因正反向引物序列为：
[0012] F:5’—GACAGCTTGGCACAGTGCAA—3’，
[0013] R:5’—CACCCATGGATCACCACAAA—3’；
[0014] 以及鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物序列为
[0015] F:5’—GTCCACCGCAAATGCTTCT—3’，
[0016] R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。
[0017] 与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
[0018] 1、LPL荧光定量RT-PCR试剂盒，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、自动化程度高，无污染、实时性好等优点；
[0019] 2、脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase，LPL)分别是脂肪酸分解过程中的关键酶，对肌内脂肪沉积有着非常重要的影响。LPL能够将血液中乳糜微粒和极低密度脂蛋白所携带的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，向有关组织提供合成甘油三酯所需的原料，对脂肪沉积起着重要的调控作用。研究LPL基因的表达调控对于了解肉鸡机内脂肪积规律和脂质代谢调控机理具有重要意义。
[0020] 3、本实用新型是操作人员利用伸缩组件将盛装试剂瓶的垫板从下向上拉出，以使得试剂瓶高出试剂盒体，进而便于操作人员便捷地、快速地取出试剂瓶。
具体实施方式
[0032] 下面结合附图对本实用新型做进一步的说明。
[0033] 一种鸡脂肪酸分解代谢相关的LPL基因荧光定量RT-PCR试剂盒，如图1和图2所示，包括盒体1和盖体2，在盒体1内设置有盛装试剂瓶4的垫板11，其中垫板11通过滑动件与盒体1内壁连接；在盖体2 的内壁固接有升降垫板11的伸缩组件3。
[0034] 如图1和图2所示，滑动件包括突出于垫板11侧面的滑块111、及固接于盒体1内的导轨12，在导轨12的顶端做封闭处理，可防止滑块111 滑脱导轨12。
[0035] 为了盛放不同种类的试剂瓶4，如图1、图2及图5所示，在垫板11 的上表面贯穿有不同直径大小的盛装孔112，其中盛装孔112直径大小分别为盛装孔A112-1<盛装孔B112-2<盛装孔C112-3<盛装孔D112-4<盛装孔 E112-5。
[0036] 为了防止试剂瓶4倾斜，如图3和图4所示，在垫板11的下方填充有海绵垫5，海绵垫5对应盛装孔112开设有放置孔51，以便于试剂瓶4 平稳地放置于海绵垫5内，在上述条件下，对应不同的盛装孔112放置盛装不同试剂的试剂瓶4，进而可通过盛装孔112以区分试剂瓶4盛装试剂的种类。
[0037] 为了升降垫板11，以便于操作人员快速地、便捷地取出试剂瓶4，如图1和图2所示，伸缩组件3采用的是固接于垫板11的四根自锁式伸缩杆，其中盒体1上表面的四周边均对应导轨12开设有贯穿孔113，使得自锁式伸缩杆的一端从贯穿孔113内固接于垫板11的上表面，其另一端固接于盖体2的内表面。
[0038] 如图1、图2及图6所示，为了便于盖体2带动自锁式伸缩杆自由伸缩，自锁式伸缩杆包括长杆A32和短杆B31，且长杆A32的直径＜短杆B31 的直径；其中长杆A32的一端穿过贯穿孔113与垫板11固接，其另一端贯穿盒体1与短杆B31通过锁紧件固接于一体，且所述短杆B31的长度等于盖体2的厚度，长杆A32的长度等于盒体1的深度。
[0039] 其中，自锁式伸缩杆是现有的，如图6所示，在长杆A32和短杆B31 之间的连接处安装有自锁组件33，当双向旋转自锁组件33时，可对长杆A32和短杆B31收放自如，进而实现根据需要调整自锁式伸缩杆的长度，及垫板11的升降高度。
[0040] 当操作人员需要取出试剂瓶4时，操作人员向上拉动盖体2，使得自锁式伸缩杆的底端带动垫板11沿盒体1内侧的导轨12向上滑动，垫板 11的滑块111与导轨12的封闭端抵触时，按照操作人员的需要将自锁式伸缩杆的长度锁定，进而将垫板11的位置固定，使得试剂瓶4露出盒体 1外，以便于操作人员使用；不使用时，将盖体2复位。
[0041] 本实用新型的使用过程：将试剂瓶A42盛装SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物、试剂瓶B43盛装鸡LPL基因表达的特异性正反向引物、试剂瓶C44盛装鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物、试剂瓶 D45盛装dNTP、试剂瓶E46盛装灭菌DEPC水；本申请的试剂盒可适用于 LPL基因在隐性白羽鸡公母鸡不同组织中差异表达量分析，具体分析方法如下：
[0042] 隐性白羽鸡属于快大白羽肉鸡，是江苏省家禽科学研究所于1999年从法国SASSO公司引进公鸡800只，母鸡2800只，经过闭锁群体选育保存下来的。其羽毛的白色为隐性遗传。以生长速度快、产蛋多而著称，年产蛋量为200个左右，31w达产蛋高峰期，公母鸡体重分别为3,009±150 和2,257±180克。具有繁殖力强，适应性广，我国大量从国外引进隐性白羽鸡，主要用于与国内地方鸡种进行配套，以三元杂交为主的方式生产优质黄羽肉鸡。配套利用优势明显等优点，受到国内外很多养殖户的青睐。
[0043] 利用常用的Trizol裂解法，从217日龄(产蛋高峰期)的隐性白羽鸡公母鸡的下丘脑、肝脏、心脏、胸肌、腓肠肌、腹脂、锁骨下脂肪、皮下脂肪中提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照RT-PCR试剂盒(Takara, Dalian,China)说明书反转录合成cDNA第一链。
[0044] 检测方法中LPL荧光定量RT-PCR条件的优化：
[0045] (1)引物设计：根据GenBank上登录的鸡LPL和β-actin基因mRNA 序列，利用Primer5.0和oligo6.0设计一种采用荧光定量RT-PCR检测隐性白羽鸡LPL基因表达的特异性引物，经过引物筛选与条件优化，最终选择出符合荧光定量PCR反应特点的LPL基因特异性正反向引物
[0046] F:5’—GACAGCTTGGCACAGTGCAA—3’，
[0047] R:5’—CACCCATGGATCACCACAAA—3’；
[0048] 以及作为内参基因的鸡β-actin基因特异性正反向引物
[0049] F:5’—GTCCACCGCAAATGCTTCT—3’，
[0050] R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。
[0051] (2)组织RNA的抽提与纯化：从隐性白羽鸡组织中提取总RNA并纯化；
[0052] (3)cDNA第一链的合成：以步骤(2)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；
[0053] (4)荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green I燃料法，以上述(1)设计的LPL正反向引物和β-actin基因正反向引物和(3)合成的cDNA第一链为模板，在ABI7500 fast荧光定量PCR仪上进行。即隐性白羽鸡各组织样本总RNA反转录成cDNA第一链后，分别利用LPL和β-actin基因各自优化好的条件进行real-time PCR反应，每个样品均做 3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。
[0054] 荧光定量PCR扩增体系配制如下
[0055]
[0056] real time PCR扩增的反应条件设置如下：
[0057] LPL：95℃预变性20-30s,然后40个循环的95℃变性20-30s, 退火55-60℃20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃1min,95℃10-15 s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。
[0058] β-actin：95℃预变性20s,然后40个循环的95℃变性20-30s, 退火56-59℃20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃1min,95℃10-15 s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。
[0059] 为检测反应的特异性，在real-time反应后，进行溶解曲线分析，以确定得到的产物为目的产物。扩增温度以0.5℃的增幅从60℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。结果显示如图7，β-actin和LPL基因均只有一个特异性峰，溶解温度分别为81℃和86℃。则设计的LPL引物有很好的特异性，可以进行LPL基因定量分析。
[0060] 隐性白羽鸡LPL在不同组织中差异表达结果分析，具体分析如下：
[0061] 隐性白羽鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，分别利用LPL和β-actin基因基因各自优化好的条件进行real time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β-actin基因为内参照，对LPL基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔCt法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)，以一种组织，比如肝脏ΔCt作为其他组织的参照，计算相对表达量ΔΔCt，ΔΔCt＝(ΔCt(组织) –ΔCt(肝脏)，以此来比较LPL基因相对表达量。结果见图8。
[0062] 由图8可以看出，LPL基因表达在公母鸡同一组织表达量有一定的差异。公鸡LPL基因在心脏、腹脂和皮下脂肪中表达量显著高于母鸡，母鸡 LPL基因在胸肌中的白打了显著高于公鸡，在其他组织中公母鸡LPL mRNA 表达量无显著差异。同时，LPL mRNA基因表达具有一定的组织特异性，公鸡LPL基因差异表达量是心脏>锁骨下脂肪>其他组织，母鸡LPL在不同组织中差异表达量如下：心脏>锁骨下脂肪，腹脂>皮下脂肪>其他组织。
[0063] 以上所述实施方式仅表达了本实用新型的一种或多种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。
