技术领域
[0001] 本实用新型属于生物医学技术领域，涉及一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒。
相关背景技术
[0002] 随着免疫治疗药物在肿瘤治疗过程中的逐步应用，精准检测癌症患者肿瘤组织或细胞高度表达的PD‑1/PD‑L1表达量成了个性化免疫治疗的临床关键。因为PD‑1/PD‑L1在多种肿瘤组织中被发现表达显著上调，是目前普遍公认肿瘤免疫治疗的广泛生物标志物之一。
[0003] 目前，PD‑1/PD‑L1检测方法主要有免疫组织化学技术（IHC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、定量免疫荧光（IF）和流式细胞术（FC）等多种方法。由于高效快速，IHC是应用最广泛的检测方法。但是由于客观存在染色技术及条件、抗体的特异性及病理评价标准不同等因素，导致现有PD‑1/PD‑L1检测试剂盒的灵敏度不高、特异性不高及稳定性不好。换句话说，PD‑1/PD‑L1的临床检测价值偏低。因此，非常有必要开发临床上易统一且可量化的检测试剂盒精准检测出PD‑1/PD‑L1高度表达的癌症患者，从而为个性化免疫治疗提供指导和依据。
[0004] 有鉴于此，本实用新型申请人公开了一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒。本实用新型申请不仅丰富了现有PD‑1/PD‑L1检测的技术手段，而且为改善癌症患者免疫治疗的临床获益提供了践行依据。实用新型内容
[0005] 本实用新型要解决的技术问题在于癌症患者免疫治疗时PD‑1/PD‑L1表达量检测技术的不足，提供一种可以克服上述问题或者部分地解决上述问题的用于癌症患者PD‑1/PD‑L1表达量检测和为改善免疫治疗提供践行依据的的试剂盒，从而改善癌症患者的免疫治疗质量和临床获益。
[0006] 为了达到上述目的，本实用新型采用技术方案的基本构思是：通过对管家基因的筛选、管家基因的特异性扩增引物设计及PD‑1/PD‑L1的特异性扩增引物设计，提高PD‑1/PD‑L1检测的灵敏度、特异性及稳定性。
[0007] 本实用新型的技术方案是：
[0008] 一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒，包括盒体和盒盖，所述盒体内设有用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的反应液和质控品，所述反应液中含有用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的特异性正反向引物，所述质控品包括阴性质控品、阳性质控品及内参，所述阴性质控品为灭菌无核酸酶水，所述阳性质控品为基因编辑细胞系PD‑L1表达检测细胞株，所述内参为管家基因TKT、GP1、RPL‑11、USP11和HADHAI的抗体。
[0009] 进一步地，所述试剂盒的盒盖与盒体为卡扣式连接。
[0010] 进一步地，所述盒体内设有若干个立方柱状容纳腔，所述容纳腔设置为能容纳装有反应液的试剂管，包括用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的特异性正向引物试剂管、用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的特异性反向引物试剂管、用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的灭菌无核酸酶水阴性质控品试剂管、用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的基因编辑细胞系PD‑L1表达检测细胞株阳性质控品试剂管、用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的内参管家基因TKT抗体试剂管、用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的内参管家基因GP1抗体试剂管、用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的内参管家基因RPL‑11抗体试剂管、用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的内参管家基因USP11抗体试剂管、和用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的内参管家基因HADHAI抗体试剂管。
[0011] 进一步地，所述容纳腔的内壁与所述试剂管之间设置有保护海绵，所述保护海绵的材质为凝胶，所述凝胶含有质量百分比为20%‑35%的竹琨。
[0012] 进一步地，所述容纳腔包括帽盖，所述帽盖的材质为凝胶，所述凝胶含有质量百分比为20%‑35%的竹琨。
[0013] 进一步地，一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒，所述RNA试剂盒包含有用于检测PD‑1/PD‑L1表达量的特异性正反向引物分别为管家基因TKT、管家基因GP1、管家基因RPL‑11、管家基因USP11、管家基因HADHAI、PD‑1基因PDCD‑1和PD‑L1基因CD274的特异性正反向引物。
[0014] 进一步地，所述RNA试剂盒的用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的特异性正向引物试剂管包括有管家基因TKT的特异性正向引物试剂管、管家基因GP1的特异性正向引物试剂管、管家基因RPL‑11的特异性正向引物试剂管、管家基因USP11的特异性正向引物试剂管、管家基因HADHAI的特异性正向引物试剂管、PD‑1基因PDCD‑1的特异性正向引物试剂管、PD‑L1基因CD274的特异性正向引物试剂管，所述用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的特异性反向引物试剂管包括有管家基因TKT的特异性反向引物试剂管、管家基因GP1的特异性反向引物试剂管、管家基因RPL‑11的特异性反向引物试剂管、管家基因USP11的特异性反向引物试剂管、管家基因HADHAI的特异性反向引物试剂管、PD‑1基因PDCD‑1的特异性反向引物试剂管、PD‑L1基因CD274的特异性反向引物试剂管。
[0015] 进一步地，所述管家基因TKT的正向引物序列如SEQ ID 1所示，反向引物序列如SEQ ID 2所示：
[0016] 正向引物：5´‑TCATGTCTGGCGACGTCGA‑3´ SEQ ID 1,
[0017] 反向引物：5´‑GGACTGTGCGATCTCGTAT‑3´ SEQ ID 2；
[0018] 所述管家基因GP1的正向引物序列如SEQ ID 3所示，反向引物序列如SEQ ID 4所示：
[0019] 正向引物：5´‑CACTCGTCGGGTCGACGCA‑3´ SEQ ID 3,
[0020] 反向引物：5´‑CTTTCTGTTGTCGTAGTTT‑3´ SEQ ID 4；
[0021] 所述管家基因RPL‑11的正向引物序列如SEQ ID 5所示，反向引物序列如SEQ ID 6所示：
[0022] 正向引物：5´‑ATGAACCACCCGGAGCATG‑3´ SEQ ID 5,
[0023] 反向引物：5´‑CTGGAAGTAGCACCCGAAA‑3´ SEQ ID 6；
[0024] 所述管家基因USP11的正向引物序列如SEQ ID 7所示，反向引物序列如SEQ ID 8所示：
[0025] 正向引物：5´‑GGCGCCTTCTTCCTACAAG‑3´ SEQ ID 7,
[0026] 反向引物：5´‑CCAAGAGAAGAAGGGTCCT‑3´ SEQ ID 8；
[0027] 所述管家基因USP11的正向引物序列如SEQ ID 9所示，反向引物序列如SEQ ID 10所示：
[0028] 正向引物：5´‑CCATCCTCTCGACACGGACT‑3´ SEQ ID 9,
[0029] 反向引物：5´‑GTTGAGATGTACATCCTATT‑3´ SEQ ID 10；
[0030] 所述基因PDCD‑1的正向引物序列如SEQ ID 11所示，反向引物序列如SEQ ID 12所示：
[0031] 正向引物：5´‑GCCCTGAGACAAGCGAGTGT‑3´ SEQ ID 11，
[0032] 反向引物：5´‑CCTCTCTACGCAGGTCGAAT‑3´ SEQ ID 12；
[0033] 所述基因CD274的正向引物序列如SEQ ID 13所示，反向引物序列如SEQ ID 14所示：
[0034] 正向引物：5´‑GCGACACCTCTAACTGTGA‑3´ SEQ ID 13
[0035] 反向引物：5´‑GAACGTCGGACAAGAGTAG‑3´ SEQ ID 14。
[0036] 进一步地，一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒，所述RNA试剂盒还包括有反转录预混合液、库扩增混合液A、库扩增混合液B、100%乙醇、PCR级水、磁珠和缓冲液；
[0037] 优选地，反转录预混合液包括有LabScript M‑MuLV RTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、三羟甲基氨基甲烷缓冲液；
[0038] 优选地，库扩增混合液A：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、dNTP Mixture和AmpliTaq Gold DNA 聚合酶；
[0039] 优选地，库扩增混合液B：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、dNTP Mixture和Taq DNA聚合酶。
[0040] 进一步地，一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒，所述RNA试剂盒的使用方法包括以下步骤：第一步，提取待测样本中的RNA并反转录为cDNA；第二步，以cDNA 为模板特异性扩增PD‑1基因、PD‑L1基因、管家基因TKT、管家基因GP1、管家基因RPL‑11、管家基因USP11及管家基因HADHAI；第三步，构建测序文库并进行测序；第四步，对测序数据进行分析，计算管家基因TKT、管家基因GP1、管家基因RPL‑11、管家基因USP11及管家基因HADHAI测序数据量相对于其标准值的倍数，并获取中位数，同时对PD‑1/PD‑L1表达量进行标准化，得到RPM‑PDL1值；第五步，结果报告：如果RPM‑PDL1≥5，则待测样本为阳性样本；如果RPM‑PDL1＜1，则待测样本为阴性样本；如果1≤RPM‑PDL1＜5，则为弱阳性样本。
[0041] 进一步地，所述癌症样本包括有细胞、组织、血清、血浆和培养上清；所述组织包括无法用常规IHC检测的组织保存液浸泡过的癌症病人的组织样本或者是穿刺样本。
[0042] 进一步地，本实用新型提供了上述RNA试剂盒在癌症免疫治疗过程中监测免疫反应的应用技术方案，所述应用技术方案中的管家基因包括TKT、GP1、RPL‑11、USP11及HADHAI。
[0043] 进一步地，本实用新型提供了提供上述RNA试剂盒在预测肿瘤免疫药物疗效中的应用技术方案，所述肿瘤免疫药物包括有PD‑1抑制剂、PD‑L1抑制剂、CTLA‑4抑制剂、mRNA药物、环状RNA药物。
[0044] 进一步地，一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒的优选应用技术方案为肿瘤免疫药物疗效预测应用，具体如下：
[0045] 在患者接受大剂量肿瘤免疫药物治疗4天后于第7天提取肿瘤组织或抽取外周血，对肿瘤组织或提取的血清进行PD‑1/PD‑L1表达量检测，获得报告结果，如果上述PD‑1/PD‑L1表达量降低的比例大于等于25%，可判定为肿瘤免疫药物治疗有效。此外，如果待测样本报告结果为阳性，建议首先考虑进行PD‑1抑制剂和PD‑L1抑制剂等常规肿瘤免疫药物治疗。
[0046] 进一步地，一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒的优选应用技术方案为可编程环状RNA肿瘤免疫药物的个体化定制，具体如下：
[0047] 在患者接受大剂量肿瘤免疫药物治疗4天后于第7天提取肿瘤组织或抽取外周血，对肿瘤组织或提取的血清进行PD‑1/PD‑L1表达量检测，获得报告结果，如果上述PD‑1/PD‑L1表达量降低的比例低于25%，可判定为肿瘤免疫药物治疗效果有限，建议早期进入二线治疗或进行可编程环状RNA肿瘤免疫药物的个体化定制治疗。此外，如果待测样本报告结果为阴性或弱阳性，建议早期进入二线治疗或进行可编程环状RNA肿瘤免疫药物的个体化定制治疗。
[0048] 本实用新型的有益效果是：
[0049] 第一，提供一种用于PD‑1/PD‑L1表达量检测的RNA试剂盒，克服目前PD‑1/PD‑L1检测试剂盒灵敏度低、特异性不高及稳定性差的问题，从而可以精准辅助医生制定癌症患者的免疫治疗策略，切实提高癌症患者临床治疗收益；
[0050] 第二，提供上述RNA试剂盒在预测环状RNA药物疗效中的应用，根据PD‑1/PD‑L1表达量变化即可早期预测患者免疫治疗效果，对治疗无效患者可早期进入二线治疗或个性化免疫治疗环状RNA药物定制，避免不必要的免疫治疗，从而免于承受其副作用，克服目前缺少环状RNA肿瘤类免疫药物疗效预测指标的问题；
[0051] 第三，本实用新型所述试剂盒所述容纳腔设置有保护海绵和帽盖，所述海绵和帽盖的配套使用可防止试剂管在容纳腔内随意移动，保证运输安全；所述海绵和帽盖的抑菌和抗菌功能有利于保障检测工作人员的身体健康和生命安全。
