技术领域
[0001] 本实用新型属于生物医学技术领域，尤其涉及一种检测2型糖尿病合并冠心病的检测试剂盒。
相关背景技术
[0002] 2型糖尿病是一种常见的代谢性疾病，其患病率逐年增长。目前，2型糖尿病已经不再只是发达国家的富贵病，包括中国在内的发展中国家也已经变成了2型糖尿病的重灾区。2型糖尿病一般会引起全身血管破坏损伤，因为其受累血管遍及全身，且不可逆转，因此，2型糖尿病已经成为现代疾病中的重要杀手。
[0003] 血糖的持续升高是2型糖尿病患者的显著特点，长期高血糖使2型糖尿病患者患心血管疾病的概率较非糖尿病人显著提高，而糖尿病合并冠心病则是其心血管并发症致死或致残的主要原因。患2型糖尿病合并冠心病是糖尿病性冠心病的一种，是在2型糖尿病的基础上导致冠状动脉粥样硬化或冠状动脉功能改变，心脏血腔狭窄、阻塞或心脏局部缺血、缺氧甚至坏死的心脏病。因此，需要实现2型糖尿病合并冠心病的早诊断和早治疗，从而提升患者的生存质量。实用新型内容
[0004] 本实用新型的目的在于提供一种检测2型糖尿病合并冠心病的检测试剂盒来实现2型糖尿病合并冠心病患者的早诊断和早治疗。
[0005] 为实现上述目的，本实用新型提供了如下技术方案:
[0006] 本实用新型提供了一种检测2型糖尿病合并冠心病的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括盒体和盒盖，所述盒体的内部设置有可拆卸的支撑座，所述支撑座设置有6个圆形的孔洞，孔洞中分别设置有PCR反应试剂管，上游引物试剂管，下游引物试剂管，灭菌水管，阳性对照管，阴性对照管；
[0007] 所述上游引物试剂管中含有检测LncRNA‑AC141930.2表达的上游引物，所述上游引物的序列为5 '‑GGCTGCACATTCGTTACCAC ‑3 '；
[0008] 所述下游引物试剂管中含有检测LncRNA‑AC141930.2表达的下游引物，所述下游引物的序列为5 '‑ACGACCACAGTGACTCAACC‑3 '。
[0009] 优选地，所述盒体的下部设置有抽屉，所述抽屉上设置有抽屉把手，所述抽屉中设置有可拆卸的96孔PCR板。
[0010] 优选地，所述盒体为长方形。
[0011] 优选地，所述PCR反应试剂管中含有TB Green Premix Ex Taq II试剂。
[0012] 优选地，所述灭菌水管中含有灭菌水。
[0013] 优选地，所述阳性对照管中含有阳性对照液。
[0014] 优选地，所述阴性对照管中含有阴性对照液。
[0015] 优选地，所述检测试剂盒为PCR检测试剂盒
[0016] 本实用新型的有益效果在于：
[0017] 使用本实用新型可以通过检测受检测者的外周血血液来检测患者是否患有糖尿病合并冠心病，检测方便且检测灵敏度和特异性高。其次，本实用新型设置可拆卸的96孔PCR板方便使用者取用后快速进行实验。
具体实施方式
[0024] 为能清楚说明本方案的技术特点，下面将结合本实用新型实施例中的附图1‑5，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所述描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下多获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
[0025] 实施例1
[0026] 本实用新型提供了一种检测2型糖尿病合并冠心病的检测试剂盒，检测试剂盒包括长方形的盒体1和盒盖2，盒体1的内部设置有可拆卸的支撑座3，支撑座3设置有6个圆形的孔洞，孔洞中分别设置有PCR反应试剂管4，上游引物试剂管5，下游引物试剂管6，灭菌水管7，阳性对照管8，阴性对照管9；
[0027] PCR反应试剂管4中含有TB Green Premix Ex Taq II试剂；
[0028] 上游引物试剂管5中含有检测LncRNA‑AC141930.2表达的上游引物，所述上游引物的序列为5 '‑GGCTGCACATTCGTTACCAC ‑3 '；
[0029] 下游引物试剂管6中含有检测LncRNA‑AC141930.2表达的下游引物，所述下游引物的序列为5 '‑ACGACCACAGTGACTCAACC‑3 '；
[0030] 灭菌水管7中含有灭菌水；
[0031] 阳性对照管8中含有阳性对照液；
[0032] 阴性对照管9中含有阴性对照液；
[0033] 盒体1的下部设置有抽屉10，所述抽屉10上设置有抽屉把手11，所述抽屉10中设置有可拆卸的96孔PCR板12,方便实验人员直接取用。
[0034] 实施例2
[0035] （1）收集正常人外周血血液（30例，健康对照组），2型糖尿病患者外周血血液（30例，2型糖尿病组），冠心病患者外周血血液（30例，冠心病组）2型糖尿病合并冠心病患者外周血血液（30例，2型糖尿病合并冠心病组），各组之间年龄，性别差异无统计学意义，患者自愿参加本研究，并填写知情同意书；
[0036] （2）糖尿病诊断标准：空腹血糖≥7.0 mmol·L－ 1，或随机血糖≥11.1 mmol·L－ 1；冠心病诊断标准：冠状动脉造影检查至少有1支心外膜大血管狭窄≥50；
[0037] （3）糖尿病合并冠心病的诊断标准：空腹血糖≥7.0 mmol•L－1，或随机血糖≥11.1 －1mmol•L 且冠状动脉造影检查至少有1支心外膜大血管狭窄≥50%；
[0038] （4）排除标准：糖尿病组排除糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、高血压病、周围动脉硬化症，正在服用降糖、降脂、降压及使用胰岛素治疗的患者；
[0039] 急慢性感染、肝肾功能不全、严重脑血管意外、恶性肿瘤、风湿、免疫系统疾病、甲亢、痛风及垂体疾病等内分泌疾病病史；
[0040] 女性患者需要排除哺乳期及妊娠可能；
[0041] 存在心理疾病的患者；
[0042] （5）抽取实验入选者的清晨空腹静脉血，使用离心机3000r/min离心15min后取上清，得到样本血清。
[0043] 实施例3
[0044] 提取样本的RNA
[0045] （1）取200ul的样本血清加入到离心管中，加入200ul的RNA裂解液，震荡混匀30s；
[0046] （2）室温下放置5min之后，12000rpm离心10min后，吸取上清至新的离心管中；
[0047] （3）加入200ul氯仿，震荡15s之后，室温下放置5min后，12000rpm离心15min，将上层的水相转移至新的离心管中；
[0048] （4）加入等体积的异丙醇，混匀后放置10min后，12000rpm离心10min，弃去上清，保留沉淀；
[0049] （5）加入500ul预冷的DEPC水配置的70%乙醇溶解沉淀后，8000转离心5min，进行1次重复后，弃去上清，室温干燥10min后，加入DEPC水，得到RNA。
[0050] 实施例4
[0051] 逆转录反应
[0052] （1）逆转录过程参照TaKaRa公司的PrimeScript™ RT reagent Kit 试剂盒进行操作;
[0053] （2）配置如下的反应体系：
[0054]试剂 使用量
5×PrimeScript Buffer（for Real Time） 2.0µl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5µl
Oligo dT Primer（50 μM）*1 0.5µl
Random 6 mers（100 μM）*1 0.5µl
Total RNA 500ng
RNase Free dH2O Up to 10µl
[0055] （3）按照如下条件在PCR仪上进行逆转录反应：
[0056] 37℃ 15 min *3；85℃ 5s；4℃静置5min。
[0057] 实施例4
[0058] PCR反应
[0059] （1）PCR反应参照TaKaRa 公司 TB Green® Premix Ex Taq™ II 试剂盒步骤进行操作；
[0060] （2）配置如下的反应体系：
[0061]试剂 使用量
TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus） 12.5µl
PCR Forward Primer（10μM） 1.0µl
PCR Reverse Primer（10μM） 1.0µl
cDNA 模板 2.0µl
灭菌水 8.5µl
Total Up to 25µl
[0062] （3）按照如下反应条件进行反应：
[0063] Step1 95℃ 30s，Step2 95℃ 5s，60℃ 30s 40 cycle；
[0064] （4）设计并合成本实用新型所要检测的LncRNA‑AC141930.2的引物序列：
[0065] 基因名称 引物序列（5 ' to 3 '） 产物长度LncRNA‑AC141930.2 GGCTGCACATTCGTTACCAC，SEQ ID NO.2 114bp
LncRNA‑AC141930.2 ACGACCACAGTGACTCAACC,SEQ ID NO.3
[0066] （5）得到的结果如图2所示。
[0067] 相较于健康对照组，2型糖尿病组的LncRNA‑AC141930.2的表达量为0.93±0.53，差异无统计学意义，冠心病组的LncRNA‑AC141930.2的表达量为1.10±0.54，差异无统计学意义，2型糖尿病合并冠心病组的LncRNA‑AC141930.2的表达量为2.40，差异具有统计学意义，同时，相较于2型糖尿病组和冠心病组的差异也同样具有统计学意义。
[0068] 根据图2的结果，绘制2型糖尿病合并冠心病组和健康对照组的ROC曲线，绘制2型糖尿病合并冠心病组和2型糖尿病组的ROC曲线，绘制2型糖尿病合并冠心病组和冠心病组的ROC曲线，得到的曲线分别如图3，图4和图5所示，其中，图3中的AUC值为0.9180，图4中的AUC值为0.9278，图5中的AUC值为0.8971，可以看出当使用LncRNA‑AC141930.2作为诊断标志物时可以有效的区分健康对照组，2型糖尿病组和合并冠心病组。
[0069] 本实用新型未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本实用新型的限制，本实用新型也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本实用新型的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本实用新型的保护范围。
