[0001] 本实用新型涉及生物测序领域，具体涉及自动化核酸滚环扩增和酶标催化底物双重放大信号的DNA测序微流控生物芯片。

[0002] 基因突变与疾病及其相关，特别是恶性肿瘤常常伴随则基因突变，人恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肺癌等存在不同比例的B‑raf基因突变，胰腺癌存在不同比例的K‑ras基因突变，PIK3CA基因突变作为肺癌、乳腺癌等肿瘤患者的早期筛查、诊断及预后判断中；并且基因突变类型也影响临床用药，因此对疾病相关基因的突变检测具有重要意义。

[0003] 目前，用于基因突变常用的检测有焦磷酸测序法、单链构象异构多态分析技术、聚合酶链反应‑限制性片段长度多态性分析、探针扩增阻滞突变系统、高分辨率溶解曲线分析技术、高效液相色谱法、微数字聚合酶链反应。上述检测方法存在检测周期长、成本高、需要昂贵设备完成。

[0004] 时检测技术(POCT)是现代医学检验领域极具潜力的新型检测技术。与传统临床检验相比，具有检测快速、操作简便、成本低、样品用量少等优点。随着各种生物传感技术如丝网印刷电极、免疫标记、酶联技术、生物芯片技术等在POCT中广泛应用，与传统的生化分析仪相比极大的缩短了分析时间并降低了检测成本，也为患者提供了自身随时监测的方便。因此，亟待开发基因突变的实时测序技术，为疾病的及时诊断和治疗提供便捷。

[0028] 下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。

[0029] 实施例1、传感电极的制备

[0030] (1)聚吡咯丙酸(PPA)的制备方法

[0031] 1)将3.8mL吡咯(55mmol)和0.3mL苄基三甲基氢氧化铵混合，然后逐渐添加2.9mL丙烯腈(55mmol)，保持温度低于40℃，过夜搅拌；

[0032] 2)过夜搅拌后，添加50mL氢氧化钾(10M)水解所得混合物并回流过夜。

[0033] 3)回流过夜后，冷却溶液，并逐渐添加HCl使溶液酸化至pH为3；水层用乙酸乙酯萃取四次，每次用30毫升溶剂，用75mL盐水冲洗结合的有机层，然后用无水硫酸镁干燥。在溶剂蒸发后，原产物通过二氯甲烷和己烷结晶，制得聚吡咯丙酸(PPA)，具体制备原理如图1所示。

[0034] (2)构建传感电极

[0035] 1)将PPA单体在玻碳电极上用0.1mA的恒定电流下电聚合成PPA膜，时间为500s；

[0036] 2)用浓度为0.1M的PBS清洗涂层电极三次，在温和的氮气流下干燥，然后在室温下，将电极浸入含有1.5wt％EDC的150μL乙腈(ACN)中，仔细冲洗1.5h；

[0037] 3)用ACN仔细冲洗电极后，作为传感电极。

[0038] 制备的PPA膜AFM表征图见附图2所示，结果显示PPA膜固定于电极上。PPA膜表面具有多空结构和亲水性，增加核酸探针的连接数量，同时提高电子的传输速度，能够提高检测效率和灵敏度。

[0039] 本实用新型中，还可以使用金属、金属氧化物、金属碳化物、导电塑料、导电聚合物、碳材料或其组合物或混合物制备，只要能将DNA检测探针固定于电极表面即可实现。

[0040] 实施例2、自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片

[0041] 自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片，结构如图3所示和图4。由图可知，生物芯片基于核酸杂交技术、核酸滚环扩增、金纳米粒子放大、电化学活性酶标记、电化学酶催化底物生成电化学活性物质通过检测电化学信号强度进一步放大实现DNA测序；

[0042] 所述生物芯片包括试剂供给单元11、检测系统1和废液收集装置9，试剂供给单元11与检测系统1的入口连接，废液收集装置9与检测系统1的出口连接；

[0043] 所述试剂供给单元包括清洗溶液储存器8、捕获探针1储存器5、待测序列溶液储存器13、滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子‑探针2复合物储存器6、滚环扩增反应液储存器7、电化学酶修饰的DNA链储存器14和底物储存器15；分别储存清洗溶液、捕获探针1、待测序列溶液、滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子‑探针2复合物和底物；捕获探针1固定在微流控通道至少一个捕获反应阵列位点与一待测序列片段的一端互补配对，待测序列的另一端与滚环扩增引发链修饰的金纳米粒子‑探针2复合物的探针2部分互补，清洗未配对的反应物，由微流控装置通入底物，电化学酶修饰的DNA链储存器14中的电化学酶修饰的DNA链能与滚环扩增引发链互补配对，在通入底物后电化学酶催化底物下转变为电化学活性物质并测量电信号，实现了滚环扩增及电化学信号的双重放大，实现DNA测序。本实施例中，清洗溶液优选为PBS溶液；电化学酶优选为碱性磷酸酶；底物优选为含氨基苯基磷酸酯的PBS溶液。试剂供给单元通过处理器产生PWM信号控制注射泵，实现样品量的动态调节。

[0044] 本发明中，检测系统主体为微流控通道3，所述微流控通道由一个或多个进样通道组成，所述进样通道设置有至少一个分流道，分流道上设置有传感电极4作为捕获反应阵列位点，各阵列位点通过地址化管理，采用ARM架构的STM32微处理器2作为核心芯片搭建电路控制注射泵，并通过信号输出线连接，实现样品和其他添加物的动态调节，性能高、成本低、功耗低；操作软件运用智能算法，深度挖掘检测数据，其中注射泵和处理器通过电源供电，注射泵由处理器通过步进电机驱动器控制，检测信号最后通过处理器传输至人机互交界面。微流控通道可由印刷、3‑D打印、微加工、电沉积或真空沉积制备。

[0045] 本发明中，所述废液储存器与检测系统的之间还连接有微流控清洗单元9，微流控清洗单元一端与微流控通道出口连接，一端与废液储存器连接，清洗单元收集的回收至底物储存器的反应液可用电化学逆向反应回收，通过设置与底物储存器连通的管道，回收至底物储存器循环利用。经反应液中的将氧化反应产物苯醌亚胺(PQI)在电极的作用下还原，生成电活性产物对氨基苯酚(PAP)输送回底物储存器，提高检测灵敏度，降低样品用量。

[0046] 本发明中，捕获探针为但不限于检测癌症、慢性病或病原微生物相关基因的核酸序列。实施例3、利用自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片的测序方法[0047] 利用所述自动化酶标催化底物放大信号的DNA测序微流控生物芯片测序的方法，包括如下步骤：

[0048] 1)在捕获反应阵列位点上修饰待测序列的核酸探针1，所述核酸探针特异识别所述待测序列测序区域；

[0049] 2)将待测序列样品通入检测系统，使待测序列的一端与修饰于捕获反应阵列位点的核酸探针1杂交，然后通入清洗液清洗，然后再通入滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/探针复合物，探针部分与待测序列的另一端杂交，使滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/探针复合物固定于传感电极表面，然后通入PBS清洗未结合滚环扩增引发片段修饰的金纳米粒子/探针复合物；

[0050] 3)通入滚环扩增反应液，利用其中的DNA聚合酶进行扩增，再通入PBS清洗，然后通入底物并在电化学酶催化下转化为电化学活性物质，由此可调高底物浓度和/或延长反应时间，实现电化学信号双重放大特效，并通过电化学方法检测，根据核酸探针序列确定待测序列。

[0051] 使用的滚环扩增反应液为但不限于含Phi29DNA聚合酶，dNTPs混合液和BSA的溶液，检测时核酸探针根据待测序列测序区域设计，对突变序列进行测序时涉及不同突变类型的序列作为探针，然后固定于传感电极上，根据传感电极的是否产生信号判断突变基因的基因型。

[0052] 以上所述实施例仅是为充分说明本实用新型而所举的较佳的实施例，本实用新型的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本实用新型基础上所作的等同替代或变换，均在本实用新型的保护范围之内。本实用新型的保护范围以权利要求书为准。