[0001] 本实用新型涉及实验器材领域，具体涉及一种铁调素基因的实时荧光PCR检测试剂盒。

[0002] 缺铁性贫血是人体对铁的需要增加或人体对铁的吸收、利用障碍引起的一种贫血，为发病率最高的贫血类型。慢性贫血是指排除溶血、出血等原因，由慢性感染性、炎症性疾病和恶性肿瘤等引起的一种贫血，其发病率在各类贫血中仅次于缺铁性贫血。两种贫血的发生均与铁代谢异常相关，临床上较难分辨。缺铁性贫血由于机体内储存铁的耗竭，临床上呈现小细胞低色素性贫血，慢性贫血多为正细胞正色素性贫血，亦有30～50％的患者呈现小细胞低色素贫血，因此普通的血常规、血涂片检测无法区分出两种贫血。目前鉴别两种贫血的“金标准”为骨髓片普鲁士蓝铁染色：缺铁性贫血骨髓染色显示细胞内、外骨髓小粒可染铁消失，铁粒幼细胞少于15％；慢性贫血骨髓染色显示细胞内可染铁消失而细胞外增多。缺乏简单有效快速的诊断指标。

[0003] 铁调素(hepcidin)最初由Krause和Park等于2000年分别从人血超滤液和尿中分离出，是一种具有抗微生物活性的小分子多肽。随后通过小鼠的基因敲除模型发现：铁调素是机体铁稳态调节中关键性负相调节分子，可抑制肠道对铁的吸收、转运及释放，使得铁大量堆积在巨噬细胞系统内。有文献提示血清铁调素水平还可作为标志物鉴别诊断临床较难分辨的肿瘤缺铁性贫血及肿瘤慢性贫血，对两种贫血的对症治疗具有指导意义。

[0004] 目前血清铁调素水平的检测方法主要有ELISA法及质谱法。而实时荧光定量PCR技术以其特异性强，定量，敏感，方便等优点已得到全世界的公认，广泛用于基因，病原体等诸多临床检测。而成熟标准的试剂盒是定量PCR成功检测的关键。实用新型内容

[0005] (一)解决的技术问题

[0006] 针对现有技术的不足，本实用新型提供了一种铁调素基因的实时荧光PCR检测试剂盒，用于检测血清中铁调素的表达水平，为缺铁性贫血和慢性贫血的鉴定提供重要的辅助指标。

[0007] (二)技术方案

[0008] 为实现以上目的，本实用新型通过以下技术方案予以实现：

[0009] 一种铁调素基因的实时荧光PCR检测试剂盒，包括盒体，所述盒体分为第一部分、第二部分和第三部分；

[0010] 所述第一部分上设有与之相铰接的盖体，所述盖体上设有橡胶块，所述橡胶块上均匀设有若干个开孔；

[0011] 所述第一部分内设有方形槽，所述方形槽的前后左右均设有限位块，所述方形槽内设有板体，所述板体的前后左右均设有第一槽体，所述板体通过减震弹簧与所述方形槽的底部固定连接；

[0012] 所述板体上放置有块体，所述块体的前后左右均设有第二槽体，所述块体上设有若干个试剂瓶孔；

[0013] 所述第二部分上设有第一抽屉，所述第一抽屉内设有带孔塑料板，所述带孔塑料板由隔板分隔成左右两部分，左半部分上均匀设有若干个第一孔体，右半部分上均匀设有若干个第二孔体；

[0014] 所述第三部分上设有第二抽屉，所述第二抽屉的底部左右间隔设置有移液枪支架，所述移液枪支架上设有卡槽，所述卡槽内设有橡胶卡块，所述第二抽屉内还设有紫外灯。

[0015] 进一步地，所述试剂瓶孔的数量为6个，且分别放置装有染料法PCR反应液的试剂瓶、铁调素基因引物的试剂瓶、内参基因引物的试剂瓶、阴性对照的试剂瓶、阳性对照的试剂瓶、去离子水的试剂瓶。

[0016] 进一步地，所述第一孔体内放置有离心管，所述第二孔体内放置有移液枪枪头。

[0017] 进一步地，所述开孔与所述试剂瓶孔的数量相同且位置相对应。

[0018] 进一步地，所述第三部分内设有蓄电池，所述第二抽屉上设有控制开关，所述蓄电池、控制开关、紫外灯相串联。

[0019] 进一步地，所述第一抽屉、第二抽屉上均设有拉手。

[0020] 进一步地，所述拉手为内嵌式结构。

[0021] (三)有益效果

[0022] 本实用新型提供了一种铁调素基因的实时荧光PCR检测试剂盒，具有以下有益效果：

[0023] 试剂瓶放置在试剂瓶孔中，下方有缓冲减震装置，上方设有保护用的橡胶块，更加牢固，不会发生倾倒，造成损失；移液枪设置在移液枪支架上的卡槽内，卡槽内的橡胶卡块可以对移液枪起到保护作用，防止硬接触造成损坏；而且紫外灯可以对其进行杀菌消毒，防止细菌对检测结果产生影响；结构简单，使用方便，可以用于检测血清中铁调素的表达水平，为缺铁性贫血和慢性贫血的鉴定提供重要的辅助指标。

[0034] 为使本实用新型实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

[0035] 一种铁调素基因的实时荧光PCR检测试剂盒，包括盒体，盒体分为第一部分1、第二部分2和第三部分3；

[0036] 第一部分1上设有与之相铰接的盖体11，盖体11上设有橡胶块9，橡胶块9上均匀设有若干个开孔10，开孔10与试剂瓶孔23的数量相同且位置相对应；

[0037] 第一部分1内设有方形槽6，方形槽6的前后左右均设有限位块8，方形槽6内设有板体12，板体12的前后左右均设有第一槽体14，板体12通过减震弹簧13与方形槽6的底部固定连接；

[0038] 板体12上放置有块体16，块体16的前后左右均设有第二槽体15，块体16上设有若干个试剂瓶孔23，试剂瓶孔23的数量为6个，且分别放置装有染料法PCR反应液的试剂瓶、铁调素基因引物的试剂瓶、内参基因引物的试剂瓶、阴性对照的试剂瓶、阳性对照的试剂瓶、去离子水的试剂瓶；

[0039] 第二部分2上设有第一抽屉4，第一抽屉4内设有带孔塑料板，带孔塑料板由隔板18分隔成左右两部分，左半部分上均匀设有若干个第一孔体17，第一孔体17内放置有离心管，右半部分上均匀设有若干个第二孔体19，第二孔体19内放置有移液枪枪头；

[0040] 第三部分3上设有第二抽屉5，第二抽屉5的底部左右间隔设置有移液枪支架20，移液枪支架20上设有卡槽，卡槽内设有橡胶卡块22，第二抽屉5内还设有紫外灯21和蓄电池，第二抽屉5上设有控制开关7，蓄电池、控制开关7、紫外灯21相串联；

[0041] 第一抽屉4、第二抽屉5上均设有内嵌式拉手。

[0042] 本实用新型中，块体16放置在板体12上，限位块8位于第一槽体14和第二槽体15内，块体16和板体12在方形槽6内可以上下运动，盖上盖体11后，试剂瓶的瓶口刚好插入橡胶块9上的开孔10内，可以起到固定的作用；

[0043] 而且，盖体11和第一部分1之间还可以设置相配套的锁定机构。

[0044] 本实用新型中，染料法(SYBR Green Ⅰ)PCR反应液的成分包含：Taq酶、缓冲液、SYBR Green Ⅰ染料，此类反应试剂为已知技术，本实用新型的染料法PCR反应液优选为PowerUp SYBR Green Master Mix(购自appliedbiosystems公司)。

[0045] 检测用引物有两对：铁调素基因引物；内参基因引物(β-actin，管家基因)。

[0046] (1)铁调素基因引物的序列为：

[0047] 正向引物：5’-CCTGACCAGTGGCTCTGTTT-3’

[0048] 反向引物：5’-CACATCCCACACTTTGATCG-3’

[0049] (2)内参基因引物的序列为：

[0050] 正向引物：5’-TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3’

[0051] 反向引物：5’-CAGCCTGGATAGCAACGTACA-3’

[0052] 对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无铁调素基因表达的cDNA样本，阳性对照为有铁调素基因表达的cDNA样本。

[0053] 本实用新型的一种铁调素基因的实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法：

[0054] (1)取离心管，分别加入染料法PCR反应液的试剂瓶、铁调素基因引物的试剂瓶、内参基因引物的试剂瓶中的试剂，加入待测样品，以及装有去离子水的试剂瓶中的去离子水，制备待测样品的qPCR扩增体系。

[0055] (2)另取两支离心管，分别制备阳性对照和阴性对照的qPCR扩增体系。

[0056] (3)反应条件：50℃变性2分钟；95℃2分钟；95℃15秒，60℃，60秒，共40个循环，每个循环后自动读数1次，60℃60秒处采集荧光信号。

[0057] (4)结果分析：分析扩增产物的溶解曲线，确定是否存在非特异性扩增；根据目的基因和内参基因的ΔCt来判断目的基因的相对表达量：ΔCt越小，说明目的基因的表达量越高。

[0058] 待测样品的qPCR扩增体系总体积20ul：其中PCR反应液10ul，待测样品(稀释10倍)2.0ul，正向引物(5μM)0.8ul，反向引物(5μM)0.8ul，去离子水6.4ul。

[0059] 阳性对照的qPCR扩增体系总体积20ul：其中PCR反应液10ul，待测样品(稀释10倍)2.0ul，正向引物(5μM)0.8ul，反向引物(5μM)0.8ul，去离子水6.4ul。

[0060] 阴性对照的qPCR扩增体系总体积20ul：其中PCR反应液10ul，待测样品(稀释10倍)2.0ul，正向引物(5μM)0.8ul，反向引物(5μM)0.8ul，去离子水6.4ul。

[0061] 试剂盒中除包括上述物质外，还可包括常规PCR测试时所需要的试剂、工具或容器以及说明书等。

[0062] 本试剂盒保存于-4℃，尽量减少反复冻融。

[0063] 本实用新型试剂盒的实际应用:

[0064] 1.引物及探针设计与合成

[0065] 分别以铁调素基因和β-actin全长cDNA序列为模板，设计并分析引物，并根据基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合。

[0066] 2.样品准备

[0067] 1)待测样本：人外周血。

[0068] 2)吸取1mL用密度梯度离心法分离淋巴细胞，收集于无RNA酶的EP管中。

[0069] 3.总RNA抽提(根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行)

[0070] 1)每管加入1ml于Trizol吹打，室温静止5min，然后转移至心的1.5ml eppendorf管中。

[0071] 2)每管加入200μl氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。

[0072] 3)4℃，12000rpm，离心15min。

[0073] 4)从每管中吸取上清至另一新的1.5ml eppendorf管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀10min。

[0074] 5)4℃，12000rpm离心10min后，去上清。

[0075] 6)加入1ml 4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。

[0076] 7)4℃，10000rpm离心5min，弃上清。

[0077] 8)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥(不需完全干燥)。

[0078] 9)加入20μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。

[0079] 4.cDNA获得(逆转录反应)

[0080] 逆转录试剂盒购自TAKARA公司。

[0081] 说明：根据操作说明书进行,均为RNase-free操作。

[0082] 1)将各反应物质按照如下反应体系进行配比：

[0083]

[0084] 2)按照如下程序反应：

[0085] 37℃15min；85℃5sec；4℃保持。

[0086] 得到的RT反应产物-cDNA可立即用于PCR，也可保存在-80℃以后使用。

[0087] 5.实时荧光PCR

[0088] 1)Real-time PCR在ABI的7300上完成。SYBR Green Ⅰ来自appliedbiosystems公司。

[0089] 将各反应物质按照如下反应体系进行配比：

[0090]试剂  
SYBR Green Master Mix 10μl
cDNA 2μl
上游引物 0.8μl
上游引物 0.8μl
RNase-free water 6.4μl

[0091] 3)反应条件：50℃变性2分钟；95℃2分钟；95℃15秒，60℃，60秒，共40个循环，每个循环后自动读数1次，60℃60秒处采集荧光信号。

[0092] 4)制作熔解曲线。PCR结束后，在95℃变性15秒；60℃，1分钟；95℃，15秒。

[0093] 6.铁调素基因表达的相对定量分析

[0094] 待测样品扩增曲线见图5，铁调素基因溶解曲线见图6，内参基因β-actin溶解曲线见图7，溶解曲线表明铁调素基因和内参基因均无非特异性扩增。根据目的基因和内参基因的ΔCt来判断目的基因的相对表达量。

[0095] 具体结果如下：

[0096]Ct值(β-actin) Ct值(铁调素)
16.72 28.76
16.35 16.17

[0097] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

[0098] 以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的精神和范围。