技术领域
[0001] 本发明涉及荧光强度试验相关技术领域，具体为实时荧光定量仪荧光强度试验方法。
相关背景技术
[0002] 实时荧光PCR是一种基于聚合酶链式反应的技术，用于检测和量化DNA或RNA的分子数量，实时荧光PCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，广泛用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析、药物筛选等领域。
[0003] 传统的实时荧光PCR实验方法，在实验时容易受到各种外界因素影响，如荧光定量仪的参数设置校准以及样品摆放位置都会对实验结果造成不可预料的影响，同时在实验数据处理时，难以将错误数据和图表筛除，造成实验成功率低，遇到意外干扰时可能需要多次重复才能完成实验，导致实验效率低下。
具体实施方式
[0060] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0061] 请参阅图1和图2，实时荧光定量仪荧光强度试验方法包括如下内容：
[0062] S1.准备样品
[0063] 在进行实时荧光强度试验之前，首先需要准备待测样品。样品包括生物学样品(如细胞、组织、血清等)、化学样品(如药物、染料等)或环境样品(如水、土壤等)。在准备样品时，需要注意样品的制备和处理方法，确保样品的质量和稳定性。
[0064] 对于生物学样品，需要进行培养、处理或预处理，以获得所需的荧光信号，下面是一些常见的处理方法：
[0065] 1.细胞培养：对于样品是细胞，首先需要进行细胞培养。细胞培养是将细胞放置在含有适当培养基、营养物和培养条件的培养皿中，使其保持生长和增殖。在培养过程中，需要定期更换培养基，保持细胞的营养供应和生长环境的稳定。培养细胞的时间和条件可能因实验的需要而有所不同。在培养细胞期间，可以添加适当的荧光探针或荧光标记物，以标记细胞或特定的细胞组分。
[0066] 2.细胞处理：在培养细胞后，可以对细胞进行处理以获得所需的荧光信号。处理的方法可以包括药物处理、基因转染、蛋白表达等。例如，通过添加药物或化合物，可以激活或抑制细胞内的特定信号通路，从而影响细胞的荧光强度。通过基因转染或蛋白表达，可以引入特定的荧光探针或标记物，使细胞或细胞组分发出荧光信号。
[0067] 3.组织处理：如果样品是组织，可以采用组织处理的方法来获得所需的荧光信号。组织处理的方法可以包括切片、染色、抗体标记等。例如，可以将组织切片并固定，然后使用荧光染料或抗体来标记特定的细胞或组分。标记后的组织可以在显微镜下观察并测量荧光强度。
[0068] 4.样品预处理：有时，为了获得所需的荧光信号，还需要对样品进行预处理。预处理的方法可以包括固定、清洗、处理等。例如，对于某些细胞或组织样品，可能需要使用适当的固定剂来固定样品，以保持其形态和结构。在固定后，还可能需要进行清洗，以去除固定剂残留物。此外，还可以进行其他处理，如蛋白酶处理、DNA酶处理等，以改变样品的特性或结构，从而获得所需的荧光信号。
[0069] 5.共培养：对于一些细胞类型或组织样品，可能需要进行共培养来模拟其在体内的相互作用或相互影响。共培养可以通过将不同类型的细胞或组织样品放置在同一培养皿中，并提供适当的培养条件来实现。共培养可以促进细胞间的相互作用，并产生特定的荧光信号。例如，可以将不同类型的细胞标记为不同的荧光颜色，通过观察和分析不同荧光信号的变化来研究细胞间的相互作用。
[0070] 6.荧光探针或标记物的使用：在进行实时荧光强度试验之前，可以使用适当的荧光探针或标记物来标记样品中的特定分子或结构。荧光探针可以是化学染料、荧光蛋白、荧光标记抗体等。通过选择适当的荧光探针或标记物，可以将样品中的特定分子标记为荧光探针，并通过测量荧光强度来获取样品中该分子的信息。例如，可以使用荧光染料来标记细胞核酸或蛋白质，通过测量荧光强度来获得核酸或蛋白质的定量信息。
[0071] 7.荧光显微镜观察：在进行实时荧光强度试验之后，可以使用荧光显微镜来观察样品中的荧光信号。荧光显微镜是一种能够观察和记录荧光信号的显微镜。通过荧光显微镜，可以观察样品中的荧光分布、形态和强度，并进行定量分析和图像记录。荧光显微镜观察可以提供对样品中荧光信号的直观和详细的了解，并进一步解释实时荧光强度试验的结果。
[0072] S2.设置实验条件
[0073] 在进行实时荧光强度试验之前，需要设置合适的实验条件。实验条件包括温度、湿度、光照等因素。这些条件会对荧光信号的稳定性和强度产生影响。在设置实验条件时，需要根据样品的特性和实验要求进行优化。下面是一些常见的样品和相应的实验条件：
[0074] 1.细胞培养：
[0075] 细胞类型：不同类型的细胞可能需要不同的培养基和培养条件。例如，培养人类肺癌细胞系A549时，通常使用DMEM培养基，添加10％胎牛血清并在37℃的培养箱中培养。
[0076] 培养时间：培养时间可以根据实验的需要进行调整。通常，细胞需要在培养皿中生长至合适的密度，以确保实验的可靠性和准确性。
[0077] 2.组织样品：
[0078] 组织类型：不同类型的组织可能需要不同的处理和处理方法。例如，对于固定的小鼠肝脏组织，可以使用4％的甲醛进行固定，并在固定后进行脱水和包埋处理。
[0079] 切片厚度：根据实验的需要，可以选择适当的切片厚度。例如，在免疫荧光染色实验中，通常选择5‑10μm的切片厚度。
[0080] 3.基因或蛋白表达：
[0081] 表达载体：根据需要表达的基因或蛋白，可以选择适当的表达载体。例如，在转染细胞中表达荧光标记的蛋白时，可以使用pEGFP‑N1或pCMV‑mCherry等荧光蛋白表达载体。
[0082] 转染方法：根据细胞类型和实验要求，可以选择适当的转染方法。例如，对于培养的哺乳动物细胞，可以使用化学转染试剂如Lipofectamine 2000进行转染。
[0083] 4.共培养实验：
[0084] 细胞类型：共培养实验通常涉及不同类型的细胞。例如，可以将肿瘤细胞和免疫细胞共培养以研究肿瘤免疫反应。
[0085] 培养条件：对于共培养实验，需要提供适当的培养条件以支持不同类型细胞的生长和相互作用。例如，可以根据细胞要求调整培养基成分和培养条件。
[0086] S3.准备实时荧光定量仪
[0087] 在进行实时荧光强度试验之前，需要准备实时荧光定量仪。首先，选择符合实验要求的实时荧光定量仪。根据实验需求，可以选择不同型号和规格的实时荧光定量仪，以满足不同样品和实验要求。其次，对实时荧光定量仪进行预热。预热的目的是使仪器的各个部件达到稳定的工作温度，以获得准确和可靠的测量结果。以下是一些常见的实验和相应的型号和规格的实时荧光定量仪的列举：
[0088] 1.实时定量PCR(qPCR)实验：用于检测DNA或RNA的定量。需要准备荧光染料和适当的荧光通道，如SYBR Green或探针染料(如TaqMan探针)。实时荧光定量仪的规格应具备适当的波长范围和荧光通道，通常为480‑550nm的激发波长和520‑600nm的检测波长。实时荧光定量仪型号可选择Applied Biosystems QuantStudio 5Real‑Time PCR System、Bio‑Rad CFX96 Real‑Time PCR Detection System或者Thermo Fisher Scientific StepOnePlus Real‑Time PCR System。
[0089] 2.荧光原位杂交(FISH)实验：用于检测DNA或RNA的特定序列的定位。需要准备荧光标记的探针和相应的荧光通道。实时荧光定量仪的规格应具备适当的波长范围和荧光通道，以适应不同荧光标记的探针。实时荧光定量仪型号可选择Leica DMi8 S Fluorescence Microscope with LAS X FISH Analysis Software、Zeiss Axio Imager.Z2 Fluorescence Microscope with ZEN FISH Analysis Software或者Nikon Ti2‑E Motorized Inverted Microscope with NIS‑Elements FISH Analysis Software。
[0090] 3.酶联免疫吸附实验(ELISA)：用于检测蛋白质或其他分子的定量。需要准备荧光标记的抗体和适当的荧光通道。实时荧光定量仪的规格应具备适当的波长范围和荧光通道，以适应不同荧光标记的抗体。实时荧光定量仪型号可选择BioTek Cytation 5Cell Imaging Multi‑Mode Reader、PerkinElmer EnVision Multilabel Plate Reader或者Tecan Spark 10M Multimode Microplate Reader。
[0091] 4.细胞活力/细胞增殖实验：用于检测细胞的活力或增殖情况。需要准备荧光染料，如细胞活力染料(如Calcein‑AM)或细胞增殖染料(如BrdU)。实时荧光定量仪的规格应具备适当的波长范围和荧光通道，以适应不同荧光染料的激发和检测。实时荧光定量仪型号可选择Promega GloMax Discover Multimode Microplate Reader、BMG LABTECH CLARIOstar Plus Multimode Microplate Reader或者Molecular Devices SpectraMax i3x Multi‑Mode Microplate Reader。
[0092] 要注意的是，不同的实验可能需要不同的荧光染料和荧光通道，具体的型号和规格的实时荧光定量仪应根据实验需求和荧光标记的特性进行选择。在选择实时荧光定量仪时，还要考虑仪器的灵敏度、分辨率、自动化程度等因素，以满足实验的要求。
[0093] S4.校准仪器
[0094] 在进行实时荧光强度试验之前，需要对实时荧光定量仪进行校准。校准的目的是消除仪器本身的背景荧光信号，以及确保荧光信号的准确和可靠。校准过程中，需要进行背景荧光校正和荧光强度基线的设置。背景荧光校正是通过测量没有荧光信号的背景样品，然后将其荧光信号减去样品的荧光信号，以消除背景荧光的影响。荧光强度基线的设置是将荧光信号的最小值设置为零，以确保荧光信号的准确性和可比性。以下是仪器校准过程中的一些注意事项：
[0095] 1.波长校准：确保仪器的激发波长和检测波长与所使用的荧光染料的要求相匹配。参考荧光染料的技术说明书，设置正确的波长范围。
[0096] 2.荧光标准品：使用荧光标准品进行校准，以确保仪器的荧光信号读数准确和可重复。根据厂商提供的指导，准备标准品并设置适当的荧光通道和增益。
[0097] 3.背景校准：进行背景校准以排除背景荧光的影响。通过读取没有样本的空白孔或背景对照，确定背景信号的基线，并相应地设置荧光阈值。
[0098] 4.参考样本校准：准备参考样本，其荧光信号已知并稳定。使用参考样本进行校准，以确保仪器的读数准确性和一致性。
[0099] 5.读数参数设置：根据实验的要求和荧光染料的特性，设置合适的读数参数，如激发波长、检测波长、积分时间等。确保读数参数能够最大限度地提取荧光信号并准确测量。
[0100] 6.校准的频率：根据实验的需要和仪器的稳定性，定期进行校准。一般建议每次实验前进行校准，以确保仪器的准确性。
[0101] 7.文档记录：在进行仪器校准时，记得详细记录校准的过程和结果。这样可以追踪校准的历史记录，并在需要时进行比较和验证。
[0102] S5.设置实时荧光定量仪参数
[0103] 在进行实时荧光强度试验之前，需要设置实时荧光定量仪的参数。参数包括荧光激发波长、荧光检测波长、采集时间等。荧光激发波长是指用于激发样品荧光的光波长，通常通过选择适当的滤光片或光源来实现。荧光检测波长是指用于检测和接收样品荧光的光波长，也可以通过选择适当的滤光片或光探测器来实现。采集时间是指每次荧光信号采集的时间，根据样品的荧光强度和稳定性来确定。确定荧光激发波长、荧光检测波长和采集时间等参数的选择主要基于以下几个因素：
[0104] 1.荧光染料的特性：首先，需要了解所使用的荧光染料的激发和发射波长。根据荧光染料的光谱特性，选择合适的激发波长和检测波长。激发波长应与染料的最大吸收波长相匹配，而检测波长应与染料的最大发射波长相匹配。
[0105] 2.仪器的可用通道：实时荧光定量仪通常具有多个荧光通道，可以同时测量多个不同的荧光信号。根据实验需求和所使用的荧光染料的数量，选择相应的荧光通道进行激发和检测。
[0106] 3.背景信号的最小化：根据实验样本的特性和所使用的荧光染料，选择合适的激发波长和检测波长以最小化背景信号。这可以通过选择与样本中的自发荧光信号相差较大的激发和检测波长来实现。
[0107] 4.荧光信号的强度和稳定性：根据荧光信号的强度和稳定性，选择适当的采集时间。采集时间应足够长以确保荧光信号的稳定性和准确性，但又不能过长以避免信号的逐渐衰减或淬灭。
[0108] S6.放置样品
[0109] 在进行实时荧光强度试验之前，需要将样品放置到实时荧光定量仪的样品舱中。样品舱是一个容器，用于容纳样品并与荧光探测器接触。在放置样品时，需要确保样品与荧光探测器之间的距离适当，并且样品的位置稳定。通常，可以使用样品舱的盖子或夹具来固定样品的位置，以避免样品在测量过程中的移动或干扰。样品与荧光探测器之间的距离可以根据仪器的要求和实验需求来确定。以下是一些常见的考虑因素：
[0110] 1.仪器的焦距和聚焦：根据仪器的光学系统和焦距，确定样品与荧光探测器之间的最佳距离。一般来说，样品应尽可能接近荧光探测器的焦平面，以确保最佳的光学聚焦和信号收集效率。
[0111] 2.焦点调节：根据荧光染料的荧光信号强度和荧光标记的细胞或分子的分布，调整样品与荧光探测器之间的距离。有时，将样品与荧光探测器放置在焦点的前方或后方，可以获得更好的信号质量和分辨率。
[0112] 3.光路设计：仪器的光路设计和光学装置的特性也会影响样品与荧光探测器之间的距离。根据仪器的设计和要求，确保样品与荧光探测器之间的距离在光学路径的范围内。
[0113] 4.防止信号损失：避免样品与荧光探测器之间的距离过大，以防止光信号的损失和衰减。在一些情况下，可能需要使用镜头或适配器来调整样品与荧光探测器之间的距离，以保持信号强度。
[0114] S7.开始测量
[0115] 在进行实时荧光强度试验之前，需要启动实时荧光定量仪，并做一些准备工作，然后开始进行荧光强度测量。根据实验需求，可以选择连续测量样品的荧光强度，并记录实时荧光数据。在测量过程中，需要确保实时荧光定量仪的稳定性和准确性。可以通过观察实时荧光数据的变化来判断样品的荧光强度和变化趋势。以下是进行实时荧光强度试验之前的准备工作：
[0116] 1.仪器预热：在开始测量之前，让实时荧光定量仪预热一段时间，以确保仪器的温度稳定。温度的稳定对于荧光探针的激发和发射是至关重要的，因此确保仪器温度在实验过程中保持恒定。
[0117] 2.稳定性检查：在开始正式测量之前，进行稳定性检查。这可以通过测量一个稳定的样品或质控样品来实现。确保荧光信号在一段时间内保持稳定，并没有明显的波动或漂移。
[0118] 3.重复性检查：在开始测量之前，进行重复性检查。这可以通过测量同一样品的多个重复样本来实现。确保测量结果的一致性和可重复性。
[0119] S8.数据分析
[0120] 在完成实时荧光强度试验后，需要对实时荧光数据进行分析。数据分析的目的是计算样品的平均荧光强度、荧光增幅曲线、荧光衰减曲线和扩增曲线。平均荧光强度是通过计算多次测量得荧光强度值的平均值来得到的，以提高结果的可靠性和准确性。荧光增幅曲线是通过绘制荧光强度与时间的关系曲线来得到的，用于评估样品的荧光增强或减弱情况。荧光衰减曲线是通过绘制荧光强度与时间的关系曲线来得到的，用于评估样品的荧光衰减或消失情况。扩增曲线是通过绘制荧光强度与PCR循环数的关系曲线来得到的。在实时荧光定量PCR实验中，PCR循环数与荧光信号的增加呈指数关系，通常表现为指数增长的曲线。扩增曲线可以用来评估PCR反应的动力学特性和扩增效率。在扩增曲线中，荧光信号随着PCR循环数的增加而增加，直到达到一个平稳的平台阶段。在平台阶段，PCR反应已经达到饱和状态，荧光信号不再增加。扩增曲线的斜率和起始模板浓度有关，斜率越陡峭表示扩增效率越高，起始模板浓度越高。扩增曲线的分析可以通过计算PCR产物的累积速度和扩增效率来确定起始模板浓度。通过斜率的计算，可以得到PCR反应的扩增效率。此外，扩增曲线还可以用于定量PCR实验中的DNA定量，根据扩增曲线的形状和斜率来确定起始模板浓度。总的来说，扩增曲线用于评估PCR反应的动力学特性和扩增效率，通过绘制荧光强度与PCR循环数的关系曲线来得到。这个曲线提供了关于PCR反应的起始模板浓度和扩增效率的信息。用于对平均荧光强度、荧光增幅曲线、荧光衰减曲线和扩增曲线进行分析的计算公式如下：
[0121] 1.平均荧光强度：
[0122]
[0123] 2.荧光增幅曲线：荧光增幅曲线可以通过绘制荧光信号随PCR循环数的变化来获得，其中荧光信号可以是平均荧光强度或荧光信号值。
[0124] 3.荧光衰减曲线：荧光衰减曲线可以通过绘制荧光信号随PCR循环数的变化来获得，其中荧光信号可以是平均荧光强度或荧光信号值。
[0125] 4.扩增曲线：扩增曲线是通过绘制荧光信号随PCR循环数的变化来获得的。扩增曲线的分析可以使用以下参数：
[0126] (1)起始模板浓度(C0)：通过扩增曲线的截距计算得出，表示PCR反应开始时的模板DNA浓度。计算公式为：
[0127]
[0128] 其中：
[0129] C0表示起始模板浓度；
[0130] Ct表示PCR循环数对应的阈值周期；
[0131] Ct0表示参考模板的阈值周期，一般为一个已知浓度的模板；
[0132] Efficiency表示PCR的扩增效率。
[0133] (2)扩增效率(Efficiency)：通过扩增曲线的斜率计算得出，表示PCR反应的扩增效率，公式如下：
[0134]
[0135] 其中：
[0136] Efficiency表示PCR扩增效率；
[0137] slope表示扩增曲线的斜率。
[0138] (3)Ct值(Threshold Cycle)：表示荧光信号达到设定阈值的PCR循环数，用于评估目标基因的表达量或样品中目标序列的相对丰度。
[0139] 计算Ct值的方法有多种，常见的方法有以下两种：
[0140] 阈值法(Threshold method)：该方法是最常用的计算Ct值的方法。在实验中，设定一个阈值，一般为荧光信号的背景噪声水平加上一个固定的标准差，当荧光信号超过该阈值时，即认为PCR反应已经进入指数增长阶段。Ct值就是荧光信号首次超过阈值的循环数。
[0141] 二次导数最大法(Second derivative maximum method)：该方法是一种自动计算Ct值的方法，适用于荧光曲线比较平缓的情况。具体的计算公式如下：
[0142] 计算一阶导数：根据PCR仪器软件提供的荧光信号数据，计算每个循环的荧光信号变化率，即一阶导数。一阶导数可以通过计算当前循环的荧光信号减去上一个循环的荧光信号来获得。
[0143] 计算二阶导数：根据一阶导数数据，计算每个循环的一阶导数的变化率，即二阶导数。二阶导数可以通过计算当前循环的一阶导数减去上一个循环的一阶导数来获得。
[0144] 找到二阶导数最大值：找到二阶导数数据中的最大值，记录该最大值对应的循环数。
[0145] 该循环数即为Ct值。
[0146] 计算荧光信号的二次导数并找到二次导数最大值对应的循环数所需的程序如下：
[0147] import numpy as np
[0148] #假设荧光信号数据存储在一个名为fluorescence的一维数组中
[0149] fluorescence＝[0.0,0.5,1.2,2.0,2.5,2.8,2.9,2.7,2.4,2.0,1.5,1.0][0150] #计算一阶导数
[0151] first_derivative＝np.gradient(fluorescence)
[0152] #计算二阶导数
[0153] second_derivative＝np.gradient(first_derivative)
[0154] #找到二阶导数最大值对应的循环数
[0155] max_idx＝np.argmax(second_derivative)
[0156] ct_value＝max_idx+1#循环数从0开始，所以需要加1
[0157] print("Ct值为：",ct_value)
[0158] S9.结果解读
[0159] 根据实时荧光数据的分析结果，可以进行结果解读。结果解读的目的是根据荧光强度的变化推断样品的特性和反应过程。例如，如果荧光强度随时间增加，则可以推断样品中存在某种物质的积累或反应的进行。如果荧光强度随时间减少，则可以推断样品中某种物质的消失或反应的结束。根据实验的目的和背景知识，可以对结果进行解读和分析，并得出相应的结论。在进行结果解读时，可以按照以下步骤进行：
[0160] 1.确定实验目的和背景知识：了解实验的目的和研究对象，掌握相关的背景知识，以便更好地解读结果。
[0161] 2.观察荧光强度变化曲线：根据实时荧光数据，观察荧光强度随时间的变化曲线。注意荧光强度的增减趋势以及变化的速率。可以将荧光强度曲线与对照组进行比较，以了解样品中的变化情况。
[0162] 3.分析荧光强度变化的原因：根据实验目的和背景知识，分析荧光强度变化的原因。考虑可能的影响因素，例如样品中的物质积累、反应的进行、物质的消失等。
[0163] 4.得出结论：根据观察和分析的结果，得出结论并解释实验结果。结论应该与实验目的相符，并能够回答研究问题。
[0164] 在实验过程中因为各种原因会出现一些奇特的异常扩增曲线，为了避免对结果解读造成影响，我们需要正确解读这些曲线并且做出恰当的解决方案。
[0165] 如图2所示，正常PCR扩增曲线呈“S”型，分为基线期、指数期、平台期。扩增曲线良好的指标是曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象。
[0166] 异常的扩增曲线有各种各样的类型，下面列举一些常见的类型：
[0167] 1.如图3所示，扩增曲线抬升，与阈值线相交产生了CT值。
[0168] 原因分析：
[0169] (1)软件在进行基线自动扣除的时候出现错误，引起了扩增曲线抬升。
[0170] (2)选用的耗材、试剂或者操作的原因导致背景荧光信号有所波动，造成反应孔的自动基线扣除错误。
[0171] (3)探针浓度过高，体系中有荧光物质污染，扩增效率低。
[0172] 解决方案：
[0173] (1)采取手动调整基线的方法，重新定义基线即可正常(即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数，基线终点设置成扩增曲线起峰的前一个循环数)。
[0174] (2)重新提取样本、重新配置试剂(可采用不同厂家试剂检测)，注意人员操作。
[0175] (3)稀释模板重新扩增。
[0176] 2.如图4所示，扩增曲线不平整，有向上或者向下的尖峰。
[0177] 原因分析：
[0178] (1)仪器不稳定导致的扩增曲线异常(也可能突然停电或者电压不稳)。
[0179] (2)尖峰向下，可能是卤素灯老化所致发射光源不稳定(指卤钨灯光源的激发器)。
[0180] (3)尖峰向上，考虑仪器或者孔位问题，还要考虑反应体系是否存有气泡。
[0181] 解决方案：
[0182] (1)检查仪器性能，检查实验室电压情况。
[0183] (2)定期仪器保养维修，避免配件老化问题出现。
[0184] (3)检查问题孔位，排除孔位问题。
[0185] (4)配制反应体系，分装避免产生大量气泡。模板加完，微孔板离心再扩增。
[0186] 3.如图5所示，扩增曲线末尾起跳。
[0187] 原因分析：
[0188] (1)阴性对照曲线末尾起跳，表示存在交叉污染。
[0189] (2)复检样本，排除非特异性扩增的可能性。
[0190] (3)正常样本曲线末尾起跳，怀疑模板存在交叉污染；或者样本浓度低、加样量不准确导致扩增效率低。
[0191] (4)所用的试剂设计不合理，或存在交叉污染，或操作环境中有气溶胶造成污染。
[0192] 解决方案：
[0193] (1)检查阴性对照，是否存在污染。
[0194] (2)复检样本，如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增，如果复检后曲线与之前一末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。
[0195] (3)更换试剂，建议使用不同厂家试剂比对。
[0196] (4)对操作环境进行处理，或更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。
[0197] 4.如图6所示，扩增曲线扩增不完整.
[0198] 原因分析：
[0199] (1)模板污染导致降解，或者样本浓度低、加样量不准确导致扩增效率低。
[0200] (2)模板浓度太高，或者存在抑制成分。
[0201] (3)荧光染料浓度低，或者仪器问题荧光收集异常。
[0202] (4)Taq酶无活性或活性降低。
[0203] (5)试剂配制没充分混匀，分装不均匀。
[0204] 解决方案：
[0205] (1)重新提取样本，排除提取效率变低，加样量不足因素。
[0206] (2)稀释模板，重新扩增。
[0207] (3)检查试剂，更换新试剂，双试剂检测。
[0208] (4)试剂配制充分混匀，分装准确。
[0209] (5)检查仪器。
[0210] S10.结果展示
[0211] 在完成实时荧光强度试验和结果解读后，将实验结果整理并展示。结果展示采用图表、表格、图像和报告相结合的形式。通过图表和表格可以直观地展示荧光强度的变化趋势和数据的统计分析结果。通过图像可以展示荧光强度的空间分布和荧光信号的强度变化。通过报告可以详细描述实验过程、结果分析和结论推断等内容。
[0212] S11.清洗和维护
[0213] 在完成实时荧光强度试验和结果展示后，需要进行实时荧光定量仪的清洗和维护工作。清洗的目的是除去样品残留物和污染物，以保持仪器的正常使用和准确性。清洗过程中，可以使用适当的溶剂和清洗剂对样品舱、光学元件和滤光片进行清洗，在清洗不同的部件时应采用不同的溶剂和清洗剂，例如：
[0214] 1.70％乙醇溶液：用于消毒和清洗仪器表面和附件，如光学透镜、探头、样品架等。
[0215] 2.去离子水：用于清洗光学透镜、探头等需要高纯度水清洗的部件。
[0216] 3.10％次氯酸钠溶液：用于消毒和清洗实验室台面、样品架等需要高效消毒的部件。
[0217] 4.去蛋白酶溶液：用于清洗探头等需要去除蛋白质残留的部件。
[0218] 5.洗涤剂：用于清洗样品架等需要去除污渍的部件。
[0219] 在使用上述溶剂和清洗剂时，需要注意以下事项：
[0220] 1.溶剂和清洗剂的选择应该根据仪器的型号和厂家提供的清洗维护指南来选择。
[0221] 2.在清洗和消毒时，需要按照指南中的要求进行操作，遵循正确的清洗和消毒程序。
[0222] 3.使用清洗剂时，应该注意稀释比例和使用时间，避免对仪器造成损害。
[0223] 4.清洗和消毒后，应该彻底冲洗干净，避免残留物对实验产生干扰。
[0224] 5.定期对仪器进行维护保养，如更换灯泡、清洗光学透镜等，以保证仪器的正常使用。
[0225] 维护的目的是保持实时荧光定量仪的性能和功能。维护工作包括定期更换滤光片、校准仪器、调整仪器参数和保养仪器设备等。
[0226] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0227] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
