技术领域
[0001] 本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及斜带石斑鱼全长性状相关的SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记、引物对、试剂盒在斜带石斑鱼选育中的用途，以及检测斜带石斑鱼全长性状的方法。
相关背景技术
[0002] 石斑鱼是名贵的海水经济鱼类。近十多年来，石斑鱼人工繁育技术已相对成熟，石斑鱼的养殖规模也逐渐扩大，石斑鱼产业的迅速发展，对于促进渔民增收，满足国民水产品需求，优化水产养殖业结构有重要意义。但是，种质退化，优良品种缺乏是石斑鱼产业可持续健康发展的主要瓶颈。因此，培育石斑鱼优良新品种已成为我国石斑鱼产业发展的关键。
[0003] 传统的鱼类选育方法完全依赖于表型，存在周期长和效率低等无法逾越的障碍。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为鱼类育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在鱼类育种中的作用将日益突出。在石斑鱼的育种中，人们希望通过对于生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而取得更大的遗传进展。
[0004] 然而，现阶段能够有效用于石斑鱼育种的生长性状相关的分子标记仍有待挖掘。
具体实施方式
[0030] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0031] 实施例1与斜带石斑鱼全长相关的SNP标记的获得
[0032] 1.1斜带石斑鱼群体的获得
[0033] 所采用的群体为海南某石斑鱼养殖场2010年11月10日孵化的斜带石斑鱼，2010年12月10日，15,000尾鱼苗被转移至一个网箱继续饲养。2011年8月8日，从该网箱随机选出199个个体，剪取鱼体背鳍鳍条于95%乙醇-20℃保存，用于基因组DNA提取。
[0034] 1.2斜带石斑鱼基因组DNA提取
[0035] 本试验采用常规酚氯仿方法抽提斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA，具体步骤如下：
[0036] （1）取0.3～0.5g鳍条于1.5ml Eppendorf管中，剪碎，在超净工作台上开盖干燥20min；
[0037] （2）待乙醇基本挥发后，TE缓冲液（10mmol/ml Tris、1mmol/ml EDTA、SDS5%，pH=8.0）洗涤1～2次，再加入600μl DNA抽提液（0.001mol/L Tris-Cl、0.1mol/L EDTA、SDS5%，pH=8.0）和3μl蛋白酶k（200mg/ml），55℃水浴消化3h左右，前30min每10min轻摇离心管1次，消化至管内液体澄清；
[0038] （3）加入自配酚氯仿溶液（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）600μl，轻轻来回颠倒离心管10min，12000r离心10min。取上层水相用等体积上述酚氯仿再抽提，直至水相与有机相之间没有白色沉淀；
[0039] （4）再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀DNA，颠倒混匀，4℃静置30min，12000r离心10min，沉淀再用70%乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加50μl无菌水溶解。4℃保存备用或-20℃长期保存。
[0040] 1.3采用基因组重测序获得斜带石斑鱼全长相关的SNP标记
[0041] 基于Hiseq2000高通量测序平台，对上述的199个个体进行重测序，产生0.5G左右的数据量，平均覆盖0.5X的斜带石斑鱼基因组。同时还对这199个个体进行全长等生长性状表型鉴定。采用PLINK软件，基于Mixed Liner模型进行GWAS分析，从7.5万个SNP中找到了一个与全长相关的SNP位点。该SNP位点位于SEQ ID NO：1所示序列的251bp位点处，在SEQ ID NO：1序列中用Y表示该处位点，且此处位点的碱基为T或C。该位点处基因型为纯合TT的斜带石斑鱼的全长显著高于此处基因型为纯合CC或杂合TC的斜带石斑鱼。
[0042] 实施例2与斜带石斑鱼全长相关的SNP标记的测序验证与应用
[0043] 2.1提取待测斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA
[0044] 待测斜带石斑鱼来自实施例1中的斜带石斑鱼群体，随机选取70尾鱼，按照实施例1中所述的DNA提取方法抽提基因组DNA。
[0045] 2.2扩增含SNP位点的核苷酸片段
[0046] 以前述提取获得的各待测斜带石斑鱼的基因组DNA为模板，利用正向 引 物 F：5’-AGGTCCTTCACAAAGCCGTCAC-3’(SEQ ID NO：2) 和 反 向 引 物 R：
5’-CGTCGCAGCATCGCCTCAAA-3’(SEQ ID NO：3)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。其中，PCR反应体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，
10mmol/L dNTP mix2.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30个循环；
72℃5分钟。
[0047] 2.3测序识别SNP位点基因型
[0048] 将上述步骤中获得的各PCR扩增产物于ABI3730测序仪上进行单向测序，识别SEQ ID NO：1序列中251bp处（即本发明的SNP标记）的基因型。其中，CC、TC和TT三种基因型的测序峰图如图1所示。70个待测斜带石斑鱼个体该SNP位点的基因型及其全长如下表1所示。
[0049] 70个个体该SNP位点的基因型及其全长
[0050]个体编号 基因型 全长(cm) 个体编号 基因型 全长(cm)
s127 CC 12.2 s183 CC 19.6
s67 CC 12.4 s38 CC 19.6
s75 CC 12.5 s112 CC 19.7
s22 CC 13.2 s164 CC 19.9
s115 CC 13.4 s88 CC 19.9
s131 CC 13.4 s150 TC 16.6
s4 CC 13.6 s194 TC 16.7
s155 CC 13.7 s1 TC 17.0
s39 CC 13.9 s111 TC 19.0
s162 CC 14.0 s35 TC 19.0
s64 CC 14.0 s2 TC 19.1
s121 CC 14.1 s8 TC 13.4
s156 CC 14.3 s176 TC 14.0
s50 CC 14.5 s143 TC 14.1
s173 CC 14.6 s140 TC 15.4
s68 CC 14.6 s66 TC 14.4
s46 CC 14.6 s65 TC 14.5
s62 CC 14.6 s142 TC 16.2
s28 CC 14.9 s105 CT 16.3
s9 CC 14.9 s116 TC 16.5
s119 CC 14.9 s99 TC 19.8
s144 CC 14.9 s89 TC 20.0
s141 CC 15.0 s168 TC 20.5
s14 CC 15.2 s174 TC 21.0
s175 CC 15.4 s26 TC 21.0
s56 CC 15.4 s118 TC 21.5
s37 CC 15.5 s82 TC 21.1
s90 CC 16.5 s163 TT 26.3
s98 CC 16.5 s190 TT 17.5
s25 CC 16.6 s125 TT 17.9
s77 CC 16.6 s73 TT 18.0
s123 CC 16.6 s7 TT 18.8
s94 CC 19.4 s41 TT 18.9
s78 CC 19.4 s97 TT 20.2
s44 CC 19.6 s83 TT 23.0
[0051]
[0052] 2.4SNP位点基因型与全长的关联分析
[0053] 基于表1的结果，利用SAS9.0软件Mixed程序进行线性模拟分析SNP位点的基因型与全长性状的关联性，其中分析时以个体全长代表表型值，采用的模型如下：
[0054] Yijk=μ+Gi+aj+eijk。
[0055] 其中，Yijk为个体全长值，μ群体全长均值，Gi为基因型效应向量，aj为微效多基因向量，eijk为随机残差效应向量。
[0056] SNP位点的基因型与全长性状的关联分析结果见下表2。
[0057] 表2SNP位点的基因型频率及与全长的关联分析
[0058]
[0059] 由表2可知，TT纯合型个体全长均值最大，TC杂合型个体全长均值次之，CC纯合型个体全长均值最小。
[0060] 表2所示的关联分析结果表明，TT基因型个体全长均值与TC基因型个体全长均值的差异达显著性水平（P<0.05），TC基因型个体全长的均值与CC基因型个体的差异达显著性水平（P<0.05），TT基因型个体全长均值与CC基因型个体全长均值的差异达极显著性水平（P<0.01）。进而，证明SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第251位碱基T或C，与斜带石斑鱼全长性状显著相关，为斜带石斑鱼全长性状相关的SNP标记，该SNP标记的TT基因型个体的全长显著高于CC和TC基因型个体。
[0061] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0062] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
