[0001] 本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及一种山羊产羔数性状相关的SNP标记，用于检测前述一组SNP标记的引物对和试剂盒，前述一种SNP标记、一组引物对、试剂盒在山羊选育中的用途，以及检测山羊产羔数性状的方法。

[0002] 山羊是最早驯化的家畜之一，它为人类提供了丰富的畜产品。山羊能够在生态条件较差的环境中生存，在世界范围内有着广泛的分布，对世界农村和牧区的发展做出了重要贡献。山羊生产中，产羔数是一个重要经济性状，提高产羔数是增加收益的有效手段。但产羔数是复杂的数量性状，涉及多个基因、位点以及位点间的相互作用，极易受到环境的影响。传统的选择手段难以取得有效进展。分子标记辅助选择，可以通过影响选择时间、选择强度以及准确性而极大地提高这类性状的选择效果。目前应用较广泛的分子遗传标记技术有：限制性片段长度多态分析技术(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机引物扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性分析技术(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)等。其中，SNP标记具有遗传稳定、突变率低、便于自动化检测等优点，因此开发与山羊多胎相关的SNP遗传标记将对培育多胎山羊新品种(系)产生重大影响。其中，目前关于山羊多胎遗传标记的研究多基于已在其它品种或物种中发现的多胎候选基因。这些在山羊多胎遗传机制研究中发现的多胎相关遗传标记多是初步的结果，并且局限于已有候选基因，利用这些结果，还难以对山羊多胎性状做出较准确的选择。因而，在全基因水平上挖掘与产羔数性状(在本文中有时也称为“多胎性状”)相关的遗传标记很有必有。

[0035] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0036] 实施例1与山羊产羔数相关的SNP标记的获得

[0037] 发明人通过RAD-seq及GWAS挖掘青山羊多胎性状相关遗传标记，以便利用这些标记可以提高山羊多胎性状选择的准确性，具体步骤如下：

[0038] 1.1青山羊血液样品的采集和DNA的提取

[0039] 1)306个样品均来自于山东翰龙羊业股份有限公司青山羊，繁殖性状见表1；

[0040] 2)基因组DNA采用酚-氯仿法提取。

[0041] 1.2RAD-seq文库构建

[0042] 文库构建方法 参考(Rapid SNP Discovery and Genetic Mapping Using Sequenced RAD Markers)，具体如下：

[0043] 1)用Taq I对基因组进行酶切，连接P1接头(含有barcode)；

[0044] 2)随机打断，连接P2接头；

[0045] 3)通过PCR筛选同时带有P1和P2接头的序列；

[0046] 4)选取400bp-700bp的片段进行测序，其中，每个样本平均得到1.2G的数据，平均测序深度15×。

[0047] 1.3关联分析

[0048] (1)采用Plink软件对上述获得的测序数据进行GWAS分析，从14万个SNP中找到了1个山羊多胎相关的SNP(见表2)。

[0049] (2)单因素方差分析表明：不同基因间产羔数存在显著差异(p＝9.42×10-5，具体为AG、GG基因型产羔数存在显著差异。

[0050] (3)采用GLM方法对所述SNP位点与产羔数进行相关性分析。

[0051] 线性模型如下：y＝μ+G+e。y：个体产羔数，μ：群体均值，G：基因型效应，e：残差。

[0052] 结果表明所述位点与产羔数显著相关(p＜0.05)，具体基因型产羔数(见表3)。

[0053] 表1 青山羊繁殖性状统计表

[0054]2012-2013年每胎产羔数 1羔 2羔 3羔 4羔 5羔 6羔 合计
个体数 78 124 79 21 3 1 306

[0055] 表2 青山羊产羔数性状相关的SNP基本信息

[0056]编号 染色体 位置a 等位基因 最小等位基因频率 Pb
位点1 Chr9 18518518 A/G 0.051 7.26×10-5

[0057] 注：a.用RAD-seq得到的SNP侧翼序列进行BLAST，将其定位在基因组中(Capra hircus CHIR_1.0)。b.全基因组关联分析显著性p值。

[0058] 图1显示了该SNP标记位点的曼哈顿图。如图1所示，横坐标为染色体编号，纵坐标为关联分析-log P值，点线为基因组水平5％显著的阈值线(6.6)，单核甘酸多态性标记的颜色对应特定染色体。

[0059] 由图1、表2所示的全基因组关联分析结果及统计信息表明：该SNP位点与山羊直-5卷毛性状极显著相关(7.26×10 )。进而，表明SNP位点为判断山羊多胎相关的SNP标记。

[0060] 表3 不同基因型产羔数的统计信息

[0061] 注：不同基因型间产羔数存在显著差异(p＝9.42×10-5)，具体为AG、GG基因型间产羔数存在显著差异，AA基因型没有进行显著性分析。

[0062] 表3所示的统计信息表明：该SNP位点的AG基因型个体中产羔数显著高于GG基-5因型的个体(p＝9.42×10 )。进而，表明该SNP位点的AG基因型可以作为判断山羊产羔数多少性状的重要标准。在山羊选育工作中可以通过保留位点基因型为AG的个体，淘汰位点基因型为GG的个体，从而逐步改良群体的繁殖性能。

[0063] 实施例2与山羊产羔数相关的SNP标记的测序验证

[0064] 2.1提取待测青山羊血液样品中的基因组DNA

[0065] 待测青山羊血液样品来自山东翰龙羊业股份有限公司青山羊，随机选取5份，按照实施例1中所述的DNA提取方法抽提基因组DNA。

[0066] 2.2扩增含SNP位点的核苷酸片段

[0067] 以前述提取获得的各待测青山羊血液样品中的基因组DNA为模板，利用正向引物GGTCACTTCATCAAAGGTTT(SEQ ID NO：2)和反向引物AGAAGTGTTGCCATCACTTT(SEQ ID NO：3)扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。该PCR扩增的扩增体系以20μl计为：25-50ng/μl的模板DNA2μl，10pmol/μl的SEQ ID NO：2-3所示的引物各0.3μl，10mmol/L的dNTP mix0.5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.2μl，10×PCR反应缓冲液2μl，余量为双蒸水；该PCR扩增的反应条件为：94℃ 5分钟；94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，35个循环；72℃ 5分钟。

[0068] 2.3测序识别SNP位点基因型

[0069] 前述步骤中所获得的PCR产物先经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，再于ABI3730测序仪上进行单向测序，识别SEQ ID NO：1序列中501bp处(即本发明的SNP标记)的基因型。其中，GG和AG三种基因型的测序峰图分别如图2a、2b所示。其中，测序时采用了反向引物序列，所以测得的序列为反向互补序列。

[0070] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0071] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。