技术领域
[0001] 本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及猪繁殖性状相关的SNP标记，一组用于检测该SNP标记的引物和试剂盒，前述SNP标记、引物、试剂盒在猪选育中的用途，以及检测猪繁殖性状的方法。
相关背景技术
[0002] 我国是猪肉消费的第一大国，然而，猪的养殖繁育技术还不够成熟，规模化养殖生产效益低，无法满足国民对猪肉产品的需求。因而，目前提高猪养殖技术，扩大猪养殖规模，迅速发展猪养殖产业，对于促进养殖户增收，满足国民对猪肉产品需求，优化猪养殖业结构有重要意义。其中，繁殖性能是猪养殖的一个重要经济性状，其是决定规模化养猪生产效益的关键因素之一。即及时、早期选择繁殖性状优良的猪进行育种、养殖，对猪育种和实际生产来说非常重要。目前虽然传统数量遗传学在指导家畜育种中起到了重要作用，但是繁殖性状遗传力低、性状表现晚，通过常规选择难以有所进展。
[0003] 分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。目前，针对繁殖性状优良的猪的选育，人们希望通过寻找影响繁殖性能的主效基因，进而筛选获得与繁殖性状密切相关的分子标记辅助育种，以便实现早期选种、提高育种准确性，并有效加快育种进展，提高猪的繁殖性能，获得较大的经济效益。
[0004] 然而，现阶段能够有效用于猪育种的繁殖性状相关的分子标记仍有待挖掘。
具体实施方式
[0033] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0034] 实施例1
[0035] 1、猪繁殖相关SNP标记的检测
[0036] 发明人利用候选基因法，选取可能与繁殖性状相关的基因，通过NCBI的SNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，调取了这些基因相关的SNP位点，然后利用Blast方法，在ensembl数据库中(http://asia.ensembl.org/Multi/Tools/Blast？db＝core)获取SNP位点周围1000bp的核苷酸序列，并设计扩增引物，采用飞行时间质谱技术，以大白猪、长白猪、杜洛克猪共338头的基因组DNA为样本，直接检测这些SNP的基因型数据；并分析了这些 SNP的基因型与猪繁殖性状的相关性。结果发现，猪17号染色体上BMP2基因上的一个SNP―rs342665431(即SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第31位碱基A或G)与猪的繁殖性能显著相关。具体如下：
[0037] 首先，以猪BMP2的包含SNP―rs342665431的部分序列为依据，在ensembl数据库中(http://asia.ensembl.org/Multi/Tools/Blast？db＝core)获取SNP位点周围1000bp的核苷酸序列，以获取的1000bp序列为模板设计引物，引物序列如下：
[0038] 1st-PCRP：5′-ACGTTGGATGAAGTAGCCTACCTTCTTGAG-3′(SEQ ID NO：2)，其中横线标注序列为该引物携带的10个碱基标签；
[0039] 2nd-PCRP：5′-ACGTTGGATGGCTTTTTGTCCACTCAGAGC-3′(SEQ ID NO：3)，其中横线标注序列为该引物携带的10个碱基标签；
[0040] UEP-PCRP：5′-CACACAAAACTTAAATATGAAGA-3′(SEQ ID NO：4)。
[0041] 接着，分别以大白猪、长白猪、杜洛克猪共338头的基因组DNA为模板(SNPs检测的群体和样品数见表5)，以1st-PCRP和2nd-PCRP为引物进行第一PCR扩增，以便获得第一PCR扩增产物，其中，模板DNA为50ng，第一PCR扩增的反应体系见表1，反应程序见表2：
[0042] 表1第一PCR扩增的反应体系
[0043]
[0044] 表2.第一PCR扩增的程序：
[0045] 94℃，2分
[0046]
[0047] 72℃，5分
[0048] 12℃，保存。
[0049] 第一PCR扩增产物片段序列如SEQ ID NO：5所示( ACGTTGGATGTGACAGGCATC TCCTTCTACTGAATCAGGC TCTTCATATTTAAGTTTTGTGTGGGGACCATTTCCAACTGAACATCCAACGT)，长93bp。
[0050] 接下来，利用AP(Alkaline Phosphatse，碱性磷酸酶，用于纯化PCR产物)将第一PCR扩增产物中未反应dNTP消化后，对第一PCR扩增产物进行第二PCR扩增，即用延伸引物UEP-PCRP紧邻SNP位点匹配，单碱基延伸SNP位点，以便获得第二PCR扩增产物。其中，第二PCR扩增的反应体系见表3；第二PCR扩增的反应程序见表4。
[0051] 表3.第二PCR扩增的反应体系
[0052]
[0053] 表4.第二PCR扩增的程序：
[0054] 94℃，2分
[0055]
[0056] 72℃，5分
[0057] 12℃，保存。
[0058] 然后，利用飞行时间质谱技术(Sequenom公司质谱仪MT09)对上述第二PCR扩增产物进行SNP多态性检测，各基因型的代表性检测结果见图1-3。其中，图1为本发明的SNP标记位点处AA基因型的飞行时间质谱检测峰图，图2为本发明的SNP标记位点处AG基 因型的飞行时间质谱检测峰图，图3为本发明的SNP标记位点处GG基因型的飞行时间质谱检测峰图。结果显示在各第二扩增产物中均包含该突变位点，即各第二扩增产物的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第31位碱基A或G。由此，表明上述SNP标记与猪的繁殖性状显著相关。
[0059] 由此，获得的3个猪品种的338个样本的基因型，然后对基因型检测结果进行统计分析，分析结果如下表6所示。由表6确定了BMP2多态性在3个猪品种中的分布情况。
[0060] 表5.SNPs检测的群体和样品数
[0061]
[0062] 表6.BMP2多态性在3个猪品种中的分布
[0063]
[0064] 注：Df＝2，χ2＝5.991，p>0.05哈代温伯格检验平衡。
[0065] 2、猪不同基因型与其繁殖性状的关联分析
[0066] 试验猪群：该研究有3种国外猪品种共338头，即大白169头，长白96头，杜洛克73头(见表5)。
[0067] 具体方法如下：
[0068] 首先，对该338头猪的繁殖性状相关指标进行记录，包括初配日龄、受胎率、分娩率、总产仔数、活仔数、胎产总仔、胎产活仔、胎产死胎、胎木乃伊、断奶头数、每胎断奶数、平均胎间距、年产胎数、年产活仔、年断奶头数、出生窝重、断奶窝重等。
[0069] 接着，采集该338头猪提取基因组DNA，按照步骤1所述的方法，通过飞行时间质谱技术检测各头猪的该SNP标记的基因型。
[0070] 然后，将试验猪群基因型与上繁殖性状即经济性状进行关联分析。其中，该关联分析是应用SAS 6.0GLM程序对繁殖性状的不同基因型之间的差异进行最小二乘方差分析。
[0071] 所采用的线性模型为：
[0072] Y＝μ+Breed+Farm+Mar ker+e
[0073] 其中，Y是性状观察值，μ为总体均值，Sex为性别效应，Breed为品种效应，Farm为猪场效应，Marker为标记效应，e为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
[0074] 应用模型根据最小二乘分析法直接分析基因型的效应，同时进行基因型间的两两比较。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表7。
[0075] 表7.猪的基因型与猪群体繁殖性状的关联分析
[0076]
[0077] 注：*表示差异显著P<0.05，**表示差异极显著P<0.01。
[0078] 结果发现，此SNP位点的不同基因型猪在总产仔数、活产仔数、断奶头数上差异极显著(P<0.01)，GG基因型猪的总产仔数、活产仔数、断奶头数均明显比AG基因型和AA基因型猪的高，并且GG基因型猪与AA基因型猪在总产仔数、活产仔数、断奶头数上均差异极显著(P<0.01)；AG基因型猪的总产仔数、活产仔数、断奶头数明显高于AA基因型猪，即GG基因型猪的繁殖性能比AA基因型和AG基因型猪的繁殖性能好，AG基因型猪比AA基因型猪的繁殖性能好。表明该SNP标记的AG基因型猪的繁殖能力显著高于AA基因型猪，而低于GG基因型猪。进一步证明了上述SNP标记与猪的繁殖性状显著相关。
[0079] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0080] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
