[0001] 本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及斜带石斑鱼体重性状相关的 SNP标记，用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记、引物对、 试剂盒在斜带石斑鱼选育中的用途，以及检测斜带石斑鱼体重性状的方法。

[0002] 石斑鱼是名贵的海水经济鱼类。近十多年来，石斑鱼人工繁育技术已相对成熟，石 斑鱼的养殖规模也逐渐扩大，石斑鱼产业的迅速发展，对于促进渔民增收，满足国民水产品 需求，优化水产养殖业结构有重要意义。但是，种质退化，优良品种缺乏是石斑鱼产业可持 续健康发展的主要瓶颈。因此，培育石斑鱼优良新品种已成为我国石斑鱼产业发展的关键。

[0003] 传统的鱼类选育方法完全依赖于表型，存在周期长和效率低等无法逾越的障碍。 分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改 良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分 子育种为鱼类育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在鱼类育种 中的作用将日益突出。在石斑鱼的育种中，人们希望通过对于生长性状密切相关，并且与数 量性状紧密连锁的DNA标记的选择，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而取得 更大的遗传进展。

[0004] 然而，现阶段能够有效用于石斑鱼育种的生长性状相关的分子标记仍有待挖掘。

[0030] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅 用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

[0031] 实施例1与斜带石斑鱼体重相关的SNP标记的获得

[0032] I. 1斜带石斑鱼群体的获得

[0033] 所采用的群体为海南某石斑鱼养殖场2010年11月10日孵化的斜带石斑鱼，2010 年12月10日，15, 000尾鱼苗被转移至一个网箱继续饲养。2011年8月8日，从该网箱随 机选出199个个体，剪取鱼体背鳍鳍条于95%乙醇-20°C保存，用于基因组DNA提取。

[0034] 1 · 2斜带石斑鱼基因组DNA提取

[0035] 本试验采用常规酚氯仿方法抽提斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA，具体步骤如 下：

[0036] (1)取0· 3〜0· 5g鳍条于I. 5ml Eppendorf管中，剪碎，在超净工作台上开盖干燥 20min ；

[0037] (2)待乙醇基本挥发后，TE 缓冲液（lOmmol/ml Tris、lmmol/ml EDTA、SDS5%， ρΗ=8· 0)洗涤 1 〜2 次，再加入 600μ I DNA 抽提液（0· OOlmol/L Tris-Cl、0. lmol/L EDTA、 SDS5%，pH=8. 0)和 3μ I 蛋白酶 k (200mg/ml)，55°C水浴消化 3h 左右，前 30min 每 IOmin 轻 摇离心管1次，消化至管内液体澄清；

[0038] (3)加入自配酚氯仿溶液(酚：氯仿：异戊醇=25 :24 :1)600 μ 1，轻轻来回颠倒离心 管lOmin，12000r离心10min。取上层水相用等体积上述酚氯仿再抽提，直至水相与有机相 之间没有白色沉淀；

[0039] (4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀DNA， 颠倒混匀，4°C静置30min，12000r离心10min，沉淀再用70%乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加 50 μ 1无菌水溶解。4°C保存备用或_20°C长期保存。

[0040] 1. 3采用基因组重测序获得斜带石斑鱼体重相关的SNP标记

[0041] 基于Hiseq2000高通量测序平台，对上述的199个个体进行重测序，产生0. 5G左 右的数据量，平均覆盖〇. 5X的斜带石斑鱼基因组。同时还对这199个个体进行体重等生长 性状表型鉴定。采用PLINK软件，基于Mixed Liner模型进行GWAS分析，从7. 5万个SNP 中找到了一个与体重相关的SNP位点。该SNP位点位于SEQ ID NO :1所示序列的381bp位 点处，在SEQ ID NO: 1序列中用Y表示该处位点，且此处位点的碱基为T或C。该位点处基 因型为纯合TT的斜带石斑鱼的体重显著高于此处基因型为纯合CC或杂合TC的斜带石斑 鱼。

[0042] 实施例2与斜带石斑鱼体重相关的SNP标记的测序验证与应用

[0043] 2. 1提取待测斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA

[0044] 待测斜带石斑鱼来自实施例1中的斜带石斑鱼群体，随机选取50尾鱼，按照实施 例1中所述的DNA提取方法抽提基因组DNA。

[0045] 2. 2扩增含SNP位点的核苷酸片段

[0046] 以前述提取获得的各待测斜带石斑鱼的基因组DNA为模板，利用正向引物F :5'-A CAGAGGAACAGACTGCGACAC-3'（SEQ ID N0:2)和反 3'（SEQ ID NO :3)，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。其中，PCR反应体系以25 μ 1计为： 50-100叩/^1模板0嫩1以1，1(^111〇1/^1引物？和1?各14 1，10臟〇1/1(1阶1311^叉2.(^1， 5U/μ I Taq DNA聚合酶0. 125 μ 1，10 X PCR反应缓冲液2. 5 μ 1，余量为双蒸水；PCR反应条 件为：94°C 5 分钟；94°C 30 秒，53°C 30 秒，72°C 30 秒，30 个循环；72°C 5 分钟。

[0047] 2. 3测序识别SNP位点基因型

[0048] 将上述步骤中获得的各PCR扩增产物于ABI3730测序仪上进行单向测序，识别SEQ ID N0:1序列中381bp处（即本发明的SNP标记）的基因型。其中，CC、TC和TT三种基因型 的测序峰图如图1所示。50个待测斜带石斑鱼个体该SNP位点的基因型及其体重如下表1

[0050] 所示。[0049] 50个个体该SNP位点的基因型及其体重

[0051]

[0052] 2. 4SNP位点基因型与体重的关联分析

[0053] 基于表1的结果，利用SAS9. 0软件Mixed程序进行线性模拟分析SNP位点的基因 型与体重性状的关联性，其中分析时以个体体重代表表型值，采用的模型如下：

[0054] Yijk=U+Gi+aj+e^k。

[0055] 其中，Yijk为个体体重值，μ群体体重均值，Gi为基因型效应向量，a」为微效多基 因向量，eijk为随机残差效应向量。

[0056] SNP位点的基因型与体重性状的关联分析结果见下表2。

[0057] 表2 SNP位点的基因型频率及与体重的关联分析

[0058]

[0059] 由表2可知，TT纯合型个体数显著高于CC型和TC型，T等位基因为优势基因。

[0060] 接着，进行卡方适合性检验，X 2=30. 25> X2atl5 (1)=3. 84,由此，进一步证明该位点 T是优势等位基因。表2所示的关联分析结果表明，TT基因型体重极显著高于CC型和TC 型（P〈0. 01)，TC基因型体重显著高于CC型（P〈0. 05)。进而，证明SEQ ID N0:1所示核苷酸 序列自5'端起第381位碱基T或C，与斜带石斑鱼体重性状显著相关，为斜带石斑鱼体重性 状相关的SNP标记，该SNP标记的TT基因型个体的体重显著高于CC和TC基因型个体。 [0061] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0062] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。