技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种核酸标记方法及标记产物和应用。
相关背景技术
[0002] DNA文库构建是测序的最基本要求，现有的DNA文库构建都是以小片段DNA(<1Kb)作为插入序列，其基本流程是：片段末端修复，末端“A”碱基连接和末端接头连接。该接头是一段已知序列的短片段(<100bp)DNA双链，接头连接完成后就可以用特异性退火到接头上的引物对目标序列进行扩增。
[0003] 上述方法虽然对于小片段DNA非常有效，但是无法对长片段DNA(10Kb～1Mb)末端进行标记，因为在接头连接之前的末端修复和末端“A”碱基连接的过程中对DNA的操作均会造成DNA分子长片段的断裂，造成假阳性末端。此外，之前的DNA提取过程和之后的缺口平移等过程也涉及对长片段DNA的操作，也会引起长片段DNA分子的断裂。这些断裂的发生导致长片段DNA文库构建的失败，或者文库质量的降低，进而影响随后的全基因组扩增和测序等。
[0004] 对长片段DNA的内部碱基进行修饰，比如甲基化修饰、乙酰化修饰、磷酸化修饰和生物素化标记等，也会造成长片段DNA断裂的问题。此外，长片段末端自连接也是核酸标记反应中常发生的现象，一般需要采取特定的化学修饰才能一定程度上避免。
[0005] 因此，能够成功实现长片段DNA标记是目前DNA文库构建、全基因组扩增和测序以及内部碱基修饰等操作的迫切需求。
具体实施方式
[0026] 下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施方式中所使用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
[0027] 以下实施方式中使用的材料来源说明如下：HeLaS3细胞系购自ATCC(货号：ATCCCCL-2.2)，低熔点琼脂糖凝胶购自Invitrogen(货号：16520-050)，DNaseI购自NEB(货号：M0303S)，脉冲场电泳系统使用购自Bio-Rad的CHEF-DR II系统，PBR322质粒、T4DNA聚合酶和BstDNA聚合酶(Large fragment)均购自NEB,pfu DNA聚合酶购自Thermo Scientific。
[0028] 我们利用长片段末端标记技术标记了DNaseI酶切后的基因组DNA产物，捕获到长片段酶切得到的DNaseI高敏感位点(DHSs)。具体操作如下：
[0029] 1、采用HelaS3细胞系，首先培养并获取104个细胞，先用含0.1％NP-40的裂解液(10mM Tris-HCl,10mM NaCl,3mM MgCl2,0.1％NP-40,pH8.0)对细胞进行弱裂解，然后用DNaseI(0.001U/μL)酶切10分钟后加入40μL EDTA(75mM)终止反应并且加入等体积的预先配置好的1.2％低熔点琼脂糖凝胶混匀(终浓度0.6％)后加入到80μL的模具中，4℃冷却至凝固。对照组酶切完成后加入蛋白酶K(0.3mg/mL)裂解细胞，并且用酚氯仿小心抽提DNA。
[0030] 2、将胶块置于5mL SDS裂解液(10mM Tris-HCl,100mM EDTA,1％SDS,pH8.0)中，37℃混匀过夜，达到完全裂解细胞释放裸露DNA的目的，取出样品切取一小块，用脉冲场电泳检测片段大小，对照组用酚氯仿抽提的DNA用常规电泳检测，如图1所示，左半部分是琼脂糖凝胶中DNA，右半部分是对照组用酚氯仿抽提后DNA。琼脂糖凝胶中的DNA片段主要在
50kbp左右，而对照组用酚氯仿抽提的DNA片段在500bp到23kbp之间都有弥散分布。证明在缓冲液中提取DNA的操作的确会损伤DNA，而琼脂糖凝胶中的DNA可以得到保护。
[0031] 3、弃裂解液，加入5mL 50mM EDTA溶液清洗胶块，每一个小时后更换EDTA一次，洗涤5遍后取出胶块用刀片切取1/3用脉冲场凝胶电泳检测片段长度范围。如图2所示，E是DNaseI酶切的实验组，N是未加酶而在琼脂糖凝胶内裂解细胞的对照组，gDNA为用酚氯仿提取的人基因组DNA，由图2可见DNaseI酶切后的片段大小大于10kb。
[0032] 4、末端修复
[0033] 再切取1/3胶块置于5ml1×NEB Buffer2中清洗3次，每次洗涤时在混匀仪上300rpm水平混匀1小时，每次清洗完成更换新的缓冲液，最后将胶块取出置于如下末端修复反应缓冲液中：
[0034]
[0035] 水平混匀反应2个小时，反应完成后将胶块取出置于5mL50mM EDTA溶液中终止反应，胶块可以在EDTA缓冲液中保存一周时间。
[0036] 5、接头准备
[0037] PCR扩增1996bp的接头：
[0038]
[0039]
[0040] 引物序列：
[0041] PBRF1：5’-AATTGCTAACGCAGTCAGGC(SEQ ID NO：1)；
[0042] PBRR3：5’-TCATCAGCGTGGTCGTGAAG(SEQ ID NO：2)。
[0043] PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸10min。
[0044] PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶检测，并且选择目的条带1996bp回收纯化。
[0045] 6、接头连接
[0046] 取出末端修复后的琼脂糖凝胶胶块切成三等份，取出其中一份加入5mL1×TE缓冲液，水平混匀1h，1h后更换新的TE缓冲液再次洗涤一遍。
[0047] 完成洗涤后将胶块浸泡在如下反应缓冲液：
[0048]
[0049] 水平混匀1小时后加入6μL T4 DNA连接酶(600U/μL)后在室温混匀过夜。
[0050] 7、缺口平移
[0051] 取出胶块加入1mL TE缓冲液清洗一遍后加入5mL TE缓冲液在室温混匀1小时，再更换1×NEB buffer2同样的方法清洗两遍。之后将胶块浸泡在1×Nitrobuffer(1×ThermoPol reaction buffer，100μM dNTP)中，50℃孵育1小时，每
15分钟混匀一次。
[0052] 最后将胶块取出浸泡在如下反应缓冲液中：
[0053]
[0054]
[0055] 50℃孵育3小时，每半个小时混匀一次。反应完成后用5mL清洗缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，100mM EDTA pH8.0，50mM NaCl)清洗两遍，最后再用1×TE缓冲液清洗2遍。
[0056] 8、多重置换扩增(MDA)
[0057] 完成缺口平移并且纯化后将胶块取出，加入3倍体积的1×TE缓冲液，65℃孵育至琼脂糖凝胶完全融化，取出5μL利用REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen)进行全基因组扩增。
[0058] 9、qPCR检测接头连接效率
[0059] 取MDA 前 的 产 物 和 MDA 后 的 产 物 分 别 进 行 qPCR 检 测，qPCR 用PBRF1(5’-AATTGCTAACGCAGTCAGGC，SEQ ID NO：1)和PBRR1(5’-CATACCCACGCCGAAACAAG，SEQ ID NO：3)。
[0060] qPCR体系如下：
[0061]
[0062] qPCR程序：延伸时间设置50秒，其它设置用标准qPCR程序。
[0063] 为引物进行扩增检测接头浓度，再根据基因组浓度计算出接头的相对浓度(pmol接头/ng基因组DNA)。如图3所示，E是实验组，N为未加酶的对照组，接头连接后实验组检测出来的接头浓度比对照组高，证明接头连接成功，对照组也能检测出接头说明胶块中存在游离的接头没有被完全洗涤。MDA后检测到实验组和对照组接头浓度虽然都有所下降，但也都能检测到，证明接头在MDA扩增后能够被保存下来。
[0064] 整个实验证明1996bp接头能够成功连接上，且整个反应可以在0.6％琼脂糖凝胶中反应以达到保护DNA不受外力损伤。
[0065] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
