技术领域
[0001] 本发明涉及SNP标记及其应用。具体地，本发明涉及与斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记，用于检测前述SNP标记的引物对和试剂盒，前述SNP标记、引物对、试剂盒在斜带石斑鱼选育中的用途，以及检测斜带石斑鱼生长速度的方法。
相关背景技术
[0002] 石斑鱼是名贵的海水经济鱼类。近十多年来，石斑鱼人工繁育技术已相对成熟，石斑鱼的养殖规模也逐渐扩大，石斑鱼产业的迅速发展，对于促进渔民增收，满足国民水产品需求，优化水产养殖业结构有重要意义。但是，种质退化，优良品种缺乏是石斑鱼产业可持续健康发展的主要瓶颈。因此，培育石斑鱼优良新品种已成为我国石斑鱼产业发展的关键。
[0003] 传统的鱼类选育方法完全依赖于表型，存在周期长和效率低等无法逾越的障碍。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为鱼类育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在鱼类育种中的作用将日益突出。在石斑鱼的育种中，人们希望通过对于生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而取得更大的遗传进展。
[0004] 然而，现阶段能够有效用于石斑鱼育种的生长性状相关的分子标记仍有待挖掘。
具体实施方式
[0031] 除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
[0032] 下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0033] 实施例1与斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记的获得
[0034] 1.1斜带石斑鱼群体的获得
[0035] 所采用的群体为海南某石斑鱼养殖场2010年11月10日孵化的斜带石斑鱼，亲本为29条野生雄鱼和12条野生雌鱼(捕获于海南三亚的南海海域)，2010年12月10日，15,000尾鱼苗被转移至一个网箱继续饲养。2011年8月8日，从该网箱随机选出198个个体，剪取鱼体背鳍鳍条于95％乙醇-20℃保存，用于基因组DNA提取。
[0036] 1.2斜带石斑鱼基因组DNA提取
[0037] 本试验采用常规酚氯仿方法抽提斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA，具体步骤如下：
[0038] (1)取0.3～0.5g鳍条于1.5ml Eppendorf管中，剪碎，在超净工作台上开盖干燥20min；
[0039] (2)待乙醇基本挥发后，TE缓冲液(10mmol/ml Tris、1mmol/ml EDTA、SDS 5％，pH＝8.0)洗涤1～2次，再加入600μl DNA抽提液(0.001mol/L Tris-Cl、0.1mol/L EDTA、SDS 5％，pH＝8.0)和3μl蛋白酶k(200mg/ml)，55℃水浴消化3h左右，前30min每10min轻摇离心管1次，消化至管内液体澄清；
[0040] (3)加入自配酚氯仿溶液(酚：氯仿：异戊醇(V:V:V)＝25：24：1)600μl，轻轻来回颠倒离心管10min，12000r离心10min。取上层水相用等体积上述酚氯仿再抽提，直至水相与有机相之间没有白色沉淀；
[0041] (4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍体积已预冷的无水乙醇沉淀DNA，颠倒混匀，4℃静置30min，12000r离心10min，沉淀再用70％乙醇洗涤，离心晾干沉淀后加50μl无菌水溶解。4℃保存备用或-20℃长期保存。
[0042] 1.3构建简化基因组测序(Restriction site Associated DNA sequencing，RAD-seq)文库并测序获得斜带石斑鱼体重相关的SNP标记
[0043] 基于Hiseq2000高通量测序平台，采用RAD简化基因组测序方法对198个个体的DNA样本进行测序，产生0.4G左右的数据量，平均覆盖0.4X的斜带石斑鱼基因组。同时还对这198个个体进行体重等生长性状表型鉴定。采用PLINK软件对数据进行处理筛选处理，然后使用基于混合线性模型的EMMAX软件进行GWAS分析，从261,366个SNP中找到了一个与体重显著相关的SNP位点。该SNP位点位于SEQ ID NO.1所示序列的501bp位点处，在SEQ ID NO.1序列中用Y表示该处位点，且此处位点的碱基为C或T。该位点处基因型为纯合TT的斜带石斑鱼的体重显著高于此处基因型为纯合CC的斜带石斑鱼。
[0044] 实施例2与斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记的测序验证与应用
[0045] 2.1提取待测斜带石斑鱼鳍条中的基因组DNA
[0046] 待测斜带石斑鱼来自实施例1中的斜带石斑鱼群体，随机选取180尾鱼，按照实施例1中所述的DNA提取方法抽提基因组DNA。
[0047] 2.2扩增含SNP位点的核苷酸片段
[0048] 以前述提取获得的各待测斜带石斑鱼的基因组DNA为模板，利用正向引物F：5’-CTCCTCTGCTGCTCAGCTTT-3’(SEQ ID NO：2)和反向引物R：5’-CCGTACCTCCACTGATGTGA-3’(SEQ ID NO：3)，扩增出待测SNP标记所在的核苷酸片段。其中，PCR反应体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 2.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃5分钟。
[0049] 2.3测序识别SNP位点基因型
[0050] 将上述步骤中获得的各PCR扩增产物于ABI3730测序仪上进行单向测序，识别SEQ ID NO：1序列中501bp处(即本发明的SNP标记)的基因型。其中，60个待测斜带石斑鱼个体该SNP位点的基因型及其体重如下表1所示。
[0051] 表1 60个个体该SNP位点的基因型及其体重
[0052]个体编号 体重(g) 基因型 个体编号 体重(g) 基因型
s127 20 CC s77 72 CC
s39 32 CC s101 74 CC
s115 36 CC s116 74 CC
s119 36 CC s18 74 CC
s75 36 CC s109 78 CC
s8 36 CC s138 80 CC
s155 38 CC s181 80 CC
s22 40 CC s98 80 CC
s66 40 CC s11 82 CC
s64 42 CC s182 90 CC
s68 46 CC s129 92 CC
s90 46 CC s172 92 CC
s13 48 CC s197 92 CC
s144 48 CC s73 100 CC
s34 48 CC s71 104 CC
s4 48 CC s135 114 CC
s62 48 CC s189 118 CC
s143 50 CC s85 132 CC
s20 50 CC s27 156 CC
s156 52 CC s95 170 CC
s102 54 CC s2 146 TT
s6 54 CC s26 150 TT
s23 56 CC s187 180 TT
s142 58 CC s174 180 TT
s175 64 CC s179 186 TT
s91 64 CC s185 190 TT
s123 66 CC s165 210 TT
s147 68 CC s188 228 TT
s69 70 CC s72 262 TT
s152 72 CC s163 262 TT
[0053] 2.4SNP位点基因型与生长速度的关联分析
[0054] 基于表1的结果，利用SAS9.0软件Mixed程序进行线性模拟分析SNP位点的基因型与生长速度的关联性，其中分析时以个体体重代表表型值，采用的模型如下：
[0055] Yijk＝μ+Gi+aj+eijk。
[0056] 其中，Yijk为个体体重值，μ群体体重均值，Gi为基因型效应向量，aj为微效多基因向量，eijk为随机残差效应向量。
[0057] SNP位点的基因型与生长速度的关联分析结果见下表2。
[0058] 表2 SNP位点的基因型频率及与体重的关联分析
[0059]
[0060] 由表2可知，TT纯合型个体体重均值比CC纯合型个体体重均值大。
[0061] 表2所示的关联分析结果表明，GT基因型个体体重的均值与TT基因型个体体重的均值的差异达极显著性水平(P<0.01)。进而，证明SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第501位碱基G或T，与斜带石斑鱼生长速度显著相关，为斜带石斑鱼生长速度相关的SNP标记，该SNP标记的TT基因型个体的生长速度显著高于CC基因型个体。
[0062] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0063] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
