[0001] 本发明涉及分子标记及其应用。具体地，本发明涉及甜瓜果皮覆纹颜色相关的分子标记，用于检测该分子标记的引物对和试剂盒，前述分子标记、引物对、试剂盒在甜瓜育种中的用途，检测甜瓜果皮覆纹颜色性状的方法以及甜瓜辅助育种方法。

[0002] 甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科甜瓜属，是一种重要的园艺作物，具有较高的商业价值和经济价值。我国已有3000多年的甜瓜栽培历史，是世界上最早栽培甜瓜的国家之一，也是目前世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家。甜瓜的果实香甜可口，是我国广大城乡人民普遍喜食的传统鲜食水果。随着经济的发展和人民生活水平的提高，国内对甜瓜的需求量日益增长。据联合国粮农组织(FAO)统计，甜瓜已进入世界十大重要水果之列。由于其色、香、味兼具，同时又含有人类营养所必需的各种成分：碳水化合物、蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、胡萝卜素、VC、VB、VB2、Vpp等，尤其是VC含量超过牛奶等动物食品的十几倍。甜瓜的果肉味甘、寒、滑，具有止渴、除烦热、利小便之功效；其瓜蒂可以入药，名苦丁香。甜瓜用途广泛，除了可以直接食用外还可以加工成瓜干、瓜脯、瓜酱等。世界范围内，其地位甚至要高于西瓜。

[0003] 随着生活水平的提高和水果品种的多样性，国内消费者对瓜果品质的要求也越来越高。瓜果育种越来越多样化，以适应市场需求。如甜瓜质地有脆、松脆、软、软而多汁、软而少汁等，甜瓜果肉有雪白、橙红、翠绿等颜色，可根据不同地区消费者的喜好进行选择。

[0004] 在现有甜瓜育种实践中，对甜瓜重要农艺性状大多是通过表现型间接对基因型进行选择，致使育种周期长，效率低，制约着甜瓜品种改良的进程。标记辅助选择，尤其是利用目标性状关联的功能性分子标记进行辅助选择，可以将传统的表型选择转变为直接的基因型选择，从而能够极大提高育种的效率，加速遗传改良。而寻找与重要的农艺性状紧密连锁的分子标记，是进行分子标记辅助选择(又称分子育种)和图位克隆的基础。因而，开发具有我国特色的重要性状基因的分子标记并进行辅助选择育种研究，意义重大。

[0005] 大小、形状和颜色是衡量水果外部品质的重要指标，同时也可以根据这些指标对水果进行分级处理。不同果蔬对其外观品质的要求不同。对甜瓜来说，颜色是甜瓜很重要的表观属性，在甜瓜达到一定成熟度时才表现出典型的果皮颜色(如甜瓜果皮颜色有绿、白、黄绿、黄、橙等)。在果实成熟期，一些甜瓜外果皮除了有果皮底色(主要颜色)，还会出现果皮覆纹(次要颜色或第二颜色)，果皮覆纹颜色可分为无、浅黄、黄、深黄、浅绿、绿、深绿和墨绿7种。以往对甜瓜果实外在颜色简单的从果实颜色单一性状统计，而忽略了覆纹颜色，可能导致分析结果不够准确。果皮颜色及果皮覆纹颜色的多样性使得甜瓜育种朝着多元化的方向发展，以适应市场对不同类型甜瓜的需求。因而，寻找与甜瓜果皮覆纹颜色性状紧密连锁的DNA标记，能够有效辅助特定果皮覆纹颜色的甜瓜的选育。

[0006] 然而，现阶段与甜瓜果皮覆纹颜色基因紧密连锁的分子标记，仍有待挖掘。

[0041] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

[0042] 实施例1F2代分离群体构建及性状调查

[0043] (1)材料

[0044] 以新疆宝丰种业有限公司提供的甜瓜“金蜜六号”的父本“K3-92-1”和母本“K1-7”为材料，构建F2代分离群体。

[0045] 父本“K3-92-1”为自交系，平均叶长21.6cm，平均叶宽29.3cm，厚皮网纹甜瓜，浅黄皮，细密网纹，无覆纹，果肉桔红色，长蒂，平均单瓜质量2.4kg，果形指数1.55，边部可溶性固形物含量7.4％，中心可溶性固形物含量11.9％。

[0046] 母本“K1-7”为哈萨克斯坦一农家品种“羊头”自交选育而成的优良单瓜系，平均叶长24.1cm，平均叶宽34.5cm，厚皮甜瓜，瓜较大，果柄端为黄绿色皮，果脐端为金黄色皮，细稀网纹，无覆纹，果肉白色，短蒂，平均单瓜质量3.0kg，果形指数1.52，边部可溶性固形物含量5.1％，中心可溶性固形物含量7.5％。

[0047] (2)群体构建

[0048] 以K1-7(P1)为母本，以K3-92-1(P2)为父本进行杂交(父本果皮底色为黄色，母本果皮底色为黄绿色；且父本果皮无覆纹，母本果皮无覆纹)，获得杂交一代(F1)，严格自花授粉后获得F2群体，共500个单株。

[0049] (3)性状调查

[0050] 在果实成熟期，根据《甜瓜种质资源描述规范和数据标准》(马双武等，2006)的描述，调查P1、P2及F2群体各单株的果皮覆纹颜色，根据表型鉴定结果，计算分离比，使用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，使用SPSS17.0对结果进行卡方检测。

[0051] 性状调查结果表明：F1带墨绿覆纹，F2群体中有256株有墨绿覆纹，190株无覆纹(见表1)。卡方检测表明，分离比接近9:7，推断该性状可能是由两个有互作作用的基因控制。

[0052] 表1甜瓜F2群体果皮墨绿覆纹性状分离比例

[0053]

[0054] χ20.05,1＝3.84

[0055] 实施例2：SNP标记分析及遗传图谱绘制

[0056] 1、SNP标记分析和遗传图构建

[0057] 1.1SNP标记分析

[0058] 取实施例1中的亲本“K1-7”(P1)、“K3-92-1”(P2)及F2群体各单株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取基因组DNA，具体如下：

[0059] 用CTAB法分别提取父母本、F1代、以及F2代个体的基因组DNA，具体方法如下：

[0060] (1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。

[0061] 其中1.5×CTAB配方如下(1L)：

[0062]CTAB 15g
1mol/L的Tris.Cl(pH为8.0) 75mL
0.5mol/L的EDTA 30mL
NaCl 61.4g

[0063] 加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。

[0064] (2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。

[0065] (3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。

[0066] (4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μL TE溶解DNA。

[0067] (5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA。

[0068] (6)将得到的父母本以及F1代、F2代个体的基因组DNA存于-20℃备用。

[0069] 然后，取1μg基因组DNA，用限制性内切酶将其随机打断，电泳回收400-600bp的DNA片段，然后基于Hiseq2000高通量测序平台的建库策略，构建各个样本的基因组文库，然后将各样本文库混合后(各样本携带有相互不容的标签)通过Agilent 2100生物分析仪和Hiseq2000高通量测序平台进行测序分析。

[0070] 根据识别标签序列得到每个个体的测序reads，运用SOAP2.20软件(可参见：Li R.et al.，2009a，SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics，通过参照将其全文并入本文)，以甜瓜DHL92为参考基因组(可参见：
Garcia-Mas et al.,2012，The genome of melon(Cucumis melo L.)，通过参照将其全文并入本文)，进行序列对比，结果用SAMtools 0.1.8、realSFS 0.983软件转换、分析(可参见：Li et al.，2009b，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.，通过参照将其全文并入本文)，鉴定每个位点，然后对结果进行过滤，过滤标准为50≤深度≤2500，位点突变概率≥95％，得到高可信度的SNP集。以SNP集为参考，过滤得到亲本与群体的基因型。

[0071] 1.2遗传图谱的构建

[0072] 大量的SNP导致很难对每个标记构建连锁遗传图谱，依据连续SNP组合而成的Bin基因构建Bin图谱能更加简单有效。

[0073] 根据亲本与群体的基因型，选择以每15个SNP为一个窗口，每次滑动一个SNP，确定每个窗口的基因型以及每个个体的交换位点，得到每个个体的Bin基因型。准备好的Bin基因型数据，使用MSTMap软件，作图法选择Regression mapping算法，作图函数选择Kosambi’s函数构建遗传图谱(可参见：Wu et al.,2008，Efficient and accurate construction of genetic linkage maps from the minimum spanning tree of a graph.，通过参照将其全文并入本文)。用缩写chr加染色体序号命名染色体，如chr01表示第1号染色体。

[0074] 其中，对测序结果进行分析比对的结果如表2所示，除去非锚定序列，在双亲本和F2群体中共检测到44722个SNP标记，平均每个SNP长为8.21Kb，每条染色体上的SNP数量不同，以第11号染色体上的SNP最少，为1894个，6号染色体上的SNP最多，达5865个；SNP在各染色体上的分布范围从1SNP/4.7Kb(3号染色体)到1SNP/4.714.5Kb(11号染色体)。经组合后，F2群体中共产生2277个Bin片段，片段长度从20Kb到4.83Mb不等，平均长度为138.95kb，构建了总遗传距离为1296.174cM的Bin遗传图谱，10号染色体图距最短(77.997cM)，1号染色体图距最长(143.278cM)。在整个F2群体全部的基因型中，有25.36％的来自父本，24.67％的来自母本，49.96％为杂合型，说明3种基因型在总基因型中的比例接近1:2:1的分离比。

[0075] 表2遗传图谱上SNP、Bin的分布

[0076]染色体 SNP Bin 遗传距离(cM)

[0077]chr01 3319 244 143.278
chr02 3743 169 109.473
chr03 5675 275 114.580
chr04 3056 191 134.128
chr05 4150 204 111.275
chr06 5865 253 125.153
chr07 4623 179 100.867
chr08 2984 160 101.795
chr09 3554 186 101.119
chr10 2764 108 77.997
chr11 1894 127 86.461
chr12 3095 181 90.048
Total 44722 2277 1296.174

[0078] 3、基因定位

[0079] 应用winQTLCart2.5软件，采用CIM(复合区间作图法)进行基因定位。具体地：根据F2群体的个体表型，与父本型性状相似的记为a，与母本型性状相似的记为b，性状居于父本和母本之间的记为h。得到全部个体的表型数据，将个体的表型数据与之前得到的基因型数据进行比较，对果皮墨绿覆纹性状进行基因定位。结果在F2群体中，果皮墨绿覆纹的分离比接近9:7。推断该性状可能是由两个有互作作用的基因控制。通过重组单株基因型和表型，同时通过重组交换单株进行精细定位，确定基因所在区域。两个基因位点分别定位在4号染色体末端和2号染色体末端。同时，该4号染色体上的基因与果皮底色控制基因位点区域相同。2号染色体上的基因定位在23 736 803 bp～23 787 235bp区间内，长度约为51Kb。进一步分析推断，果皮底色对覆纹颜色表现为上位效应，当果皮底色为黄色(aa)时，不论覆纹控制基因为何种基因型，均表现为无覆纹；而当果皮底色为黄绿色(Aa/AA)，覆纹控制基因为父本型(Bb/BB)时，果皮表面有墨绿覆纹；当果皮底色为黄绿色(Aa/AA)，覆纹控制基因为纯化母本型(bb)时，果皮表面无覆纹。

[0080] 4、分子标记开发

[0081] 将父母本均进行全基因组重测序(10X)，根据全基因组测序结果，利用SOAP软件(可参见应用链接：http://soap.genomics.org.cn/，通过参照将其全文并入本文)比对测序reads，然后用SOAPsv寻找片段差异较大的分子标记，便于用凝胶电泳区分鉴别。

[0082] 结果，选择靠近果皮覆纹颜色基因所在区段的标记M022377(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)作为候选。

[0083] 分子标记M022377(73bp)的核苷酸序列如下：

[0084] AACCAGAACGACTAAATTCTAACCTGTATAGTCATGATGATGAATTCTAACTTTTTTCAAACTATAGGGACTA(SEQ ID NO：1)。

[0085] 实施例3：分子标记的果皮覆纹颜色相关性验证

[0086] 对实施例2中确定的甜瓜果皮覆纹颜色相关分子标记M022377(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)进行验证，具体如下：

[0087] 针对上述分子标记设计引物，引物序列如下所示：

[0088] 正向引物：5’-GCCACGCTGGTAAGAAGATT-3’(SEQ ID NO：2)；

[0089] 反向引物：5’-ATGCACTCATTGCGTCGTTT-3’(SEQ ID NO：3)。

[0090] 利用上述引物对，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测来验证该标记的多态性和扩增稳定性。

[0091] 具体地，以实施例2中提取的父本、母本、F1代、和F2代的基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，获得扩增片段，其中，

[0092] PCR反应体系如下：

[0093]无菌水 20.2μl
10*Buffer(含Mg2+) 2.5μl
dNTPs(25mM) 0.15μl
Taq酶(5U/μl) 0.15μl
正向引物 0.5μl
反向引物 0.5μl
模板 1.0μl
总体积 25μl

[0094] PCR反应程序如下：

[0095] 94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，运行35个循环；最后72℃延伸3分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。

[0096] 接着，将各PCR扩增产物取部分进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1和图2。如图1所示，父本扩增产物为641bp大小的扩增片段，母本扩增产物为714bp大小的扩增片段，杂交F1代则同时含有这两种扩增片段。图2中显示了部分F2代个体的扩增片段的电泳检测结果，纯合的果皮黄色的单株均扩增出641bp的条带，纯合的果皮黄绿色的单株均扩增出714bp的条带，杂合的果皮黄绿色的单株扩增出上述两个条带。例如：AA-果皮黄绿色(纯合，母本条带)，aa-果皮黄色(纯合，父本条带)，Aa-果皮黄绿色(杂合，含有父母双方的条带)

[0097] 由此，证明该分子标记M022377(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)在父母本之间具有多态性，该分子标记与甜瓜果皮覆纹颜色性状紧密相关。并且，果皮底色对覆纹颜色表现为上位效应，当果皮底色为黄色(aa)时，不论覆纹控制基因为何种基因型，均表现为无覆纹；而当果皮底色为黄绿色(Aa/AA)，覆纹控制基因为父本型(Bb/BB)时，果皮表面有墨绿覆纹；当果皮底色为黄绿色(Aa/AA)，覆纹控制基因为纯化母本型(bb)时，果皮表面无覆纹。

[0098] 然后，利用3730测序仪对父母本的扩增片段进行测序，结果，父本的扩增片段，与母本的扩增片段相比缺失了一段序列，该序列即为前述的分子标记M022377(SEQ ID NO：1所示的核酸序列)。

[0099] 其中，父本扩增片段序列(641bp)如下所示：

[0100] GCCACGCTGGTAAGAAGATTTCAATCTGTAAAGAGGTTTGGGTACTTAAAATACGAAGGCAAATTAAGCAAACTAACTAGTTATCATTCTTCAGATATACAATTCTCCTCCATTAGAAAGTCGACTTATTGCCTCTTTGCAGACAGCTTTGTTACGTTAGATTCGTTCAATTGTAGATTTTATGATTTGATAAAATTCTCATAAACAGGTTCCACTGCAGGACTCTTTGGGAGTGTTTTATCAAACCAGAACGACTAAATTCTAACCTGTATAGTCATGATGATGAATTCTAACTTTTTTCAAACTATAGGGACTAACTAGAACGACTAAATTCTAACTTGTATAATCATCATGACTGAATTCTAACTGTTTTTCAAACCACAAGGACTATGTAATTTAACCTTTTGCTTTTTTAAGTACAATAGGAGTAAAGAGAGTTCGAACCTCATACCTTTTAGTCGAACATTCGTAAATTGGTTGAGCTATGCTAGACAATTTAACTTTTCTTTATTAAAACGGTGGGTCATACACACTTAAATAGTTAAATTAGTGAAATTAGTGAGTTTGAAAAACAAATATTGACCCAAGGTATTTAAGAGCAATAAATTAAAATTAAAAAAAAAAAACGACGCAATGAGTGC(SEQ ID NO：4)，

[0101] 母本扩增片段序列(714bp)如下所示：

[0102] GCTGGGATTAGATTTCAATCTGTAAAGAGGTTTGGGTACTTAAAATACGAAGGCAAATGAAGCAAACTAACTAGTTATCATTCTTCAGATATACAATTCTCCTCCATTAGAAAGTCGACTTATTGCCTCTTTGCAGACAGCTTTGTTACGTTAGATTCGTTCAATTGTAGATTTTATGATTTGATAAAATTCTCATAAACAGGTTCCACTGCAGGACTCTTTGGGAGTGTTTTATCAAACCAGAACGACTAAATTCTAACCTGTATAGTCATGATGATGAATTCTAACTTTTTTCAAACCATAGGGACTAACTAGAACGACTAAATTCTAACTTGTATAATCATCATGATTGAATTCTAACTTTTTTTCAAACCATAGGGACTAACTATAACGACTAAATTCTAACTTGTATAATCATCATGACTGAATTCTAACTGTTTTTCAAACCACAAGGACTATGTAATTTAACCTTTTGCTTTTTTAAGTACAATAGGAGTAAAGAGAGTTCGAACCTCATACCTTTTAGTCGAACATTCGTAAATTGGTTGAGCTATGCTAGACAATTTAACTTTTCTTTATTAAAACGGTGGGTCATACACACTTAAATAGTTAAATTAGTGAAATTAGTGAGTTTGAAAAACAAATATTGACCCAAGGTATTTAAGAGCAATAAATTAAAATTAAAAAAAAACGCATGGGGGTGGCGTACAATAA(SEQ ID NO：5)。

[0103] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0104] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。