[0001] 本发明属生物医学类技术领域，尤其涉及miR‑125a‑5p在检测胚胎早期发育潜能中的应用和miR‑125a‑5p抑制剂在制备改善胚胎早期发育产品中的应用。

[0002] 随着现代社会生活工作压力的剧增、人口的老龄化、辅助生殖技术的进步以及全面二胎政策的放开，越来越多的夫妇将生育推迟到更晚的年龄阶段，了解年龄因素对生育能力的影响变得越来越重要。母亲年龄对卵子质量、胚胎发育潜能的负面影响已经广为人知，但父亲年龄对生育力的影响知之甚少。

[0003] 多项流行病学研究结果发现与男性年龄相关的精液质量下降，包括：精子浓度、精子前向运动百分比、畸形精子率、精子DNA片段化指数(DFI)等。研究发现，DFI和氧化应激加合物(OSA)随着年龄的增长而增加，而精子DFI的增加往往与不良胚胎发育和不良妊娠结局有关。大量研究证实父亲年龄是自然流产的风险因素，并可能导致不良的生殖结局，如精神分裂症、孤独症和几种X连锁隐性和常染色体显性遗传病。所以研究男性高龄因素对生殖细胞以及胚胎发育等的影响具有一定的现实意义。

[0004] MicroRNAs(miRNAs)是一类在多种组织中发挥转录后调控基因表达重要作用的小RNA，而精子中的miRNAs可能是典型的表观遗传调控中介，可能参与精子功能的调节及早期胚胎发育。近期的一些研究将miRNA显微注射到原核(PN)期胚胎中，提供了早期胚胎发育中miRNA丰度改变可影响胚胎发育进程甚至可以诱导子代表型的直接证据。

[0005] 我们通过对高龄/年轻的精子、卵子、胚胎进行高通量测序发现了大量差异表达的miRNAs，其中miR‑125a‑5p在高龄精子、胚胎中上调表达，在高龄卵子中表达无明显差异；并且miR‑125a‑5p具有高度的人鼠保守性，并与衰老过程相关。文献报道，miR‑125a‑5p在衰老胸腺中增加，并通过靶向FoxN1参与年龄相关的胸腺退化；miR‑125a‑5p和许多miRNAs与心脏衰老相关，并表现出协同作用。而且miR‑125a‑5p在衰老内皮细胞中上调，可通过靶向RTEF‑1损害内皮细胞血管生成。同时，miR‑125a‑5p在高脂血症‑高血糖状态下升高，与氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的血管内皮细胞坏死有关，并通过靶向TET2导致线粒体功能障碍和ROS升高。在生殖系统中，miR‑125a‑5p也起着重要的作用，子痫前期胎盘组织中miR‑125a‑5p升高，miR‑125a‑5p模拟物可降低HTR8/SVneo细胞的迁移、增殖和血管生成能力，并诱导更多阻滞在S期的细胞。研究还发现，miR‑125家族是早期胚胎发育过程中母源性效应基因表达和维持的重要调控因子，显微注射miR‑125家族成员会影响母源性效应基因的表达。

[0006] 虽然既往研究发现miR‑125a‑5p在衰老、线粒体功能、母源性基因表达和维持等生物过程中发挥作用，但尚无文献报道高龄精子中高表达的miR‑125a‑5p在胚胎早期发育中的作用。在本专利中，我们发现miR‑125a‑5p在高龄小鼠精子中明显高表达；在年轻小鼠形成的原核期胚胎中显微注射miR‑125a‑5p模拟剂，可以观察到囊胚形成率明显降低、胚胎被阻滞在桑椹胚/囊胚阶段；在高龄小鼠形成的原核期胚胎中显微注射miR‑125a‑5p抑制剂，可以观察到miR‑125a‑5p抑制剂能够有效提高高龄胚胎的囊胚形成率。本发明可作为检测小鼠胚胎发育潜能及改善高龄小鼠胚胎发育的新方法，为提高胚胎质量提供新的靶点和思路。

[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明范围。

[0020] 本发明选用的小鼠为ICR小鼠，miR‑NC和miR‑125a‑5p mimics/inhibitor均购自广州锐博生物有限公司。

[0021] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

[0022] 实施例1：miR‑125a‑5p在年轻、高龄小鼠精子的表达水平本实例基于前期在高龄/年轻的精子(Sp)、卵子(Oo)、胚胎(Em)高通量测序结果，发现miR‑125a‑5p在高龄精子、胚胎中高表达(图1)，并表现出很高的人鼠同源性(图2)，进一步检测其在年轻、高龄小鼠精子的表达水平。

[0023] 1.1 6‑8周龄C57雄鼠和超过18月龄C57雄鼠颈椎脱臼处死，75％酒精喷洒其腹部，解剖下腹部取出附睾尾浸于HTF中，于体式镜下用1mL注射器轻轻划拨，使乳白色精子团缓缓游出，收集精子。

[0024] 1.2使用生理盐水，1000g，5min洗涤精子两次。取一部分精子以常规Trizol法抽提精子RNA，用miR‑125a‑5p、U6特异性反转录引物(购自锐博生物公司)进行反转录，并进行后续实时定量检测。另取部分精子进行精子染色质扩散法(SCD法)检测精子DNA损伤情况。

[0025] 1.3SCD法检测精子DNA损伤情况采用博锐德生物科技有限公司的精子DNA碎片检测试剂盒。

[0026] 1.3.1将易熔凝胶管置于80℃孵育20分钟，待其完全融化后，将易熔凝胶管置于37℃待用(易熔凝胶管从80℃转移到37℃需要至少平衡5min方可使用)。

[0027] 1.3.2取精子浓度5‑10ⅹ106/mL的待测标本60μl,加入已熔化的易熔凝胶管(注意37℃持续保温)，充分混匀，37℃孵育待用；
1.3.3将包被载玻片置于2‑8℃冰箱预冷5min后取出，迅速于载玻片包被区域加入
30μL精子悬液；
1.3.4迅速盖上盖玻片(勿对盖玻片施压)，尽量避免产生气泡，将其置于2‑8℃冰箱5min，
使其凝固；
1.3.5从冰箱中取出载玻片，小心移去覆盖在上面的盖玻片；将载玻片立即垂直浸入盛有反应液A的反应池内，20‑28℃准确反应7min；
1.3.6取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体(勿接触标本区)；
将载玻片垂直浸入盛有反应液B的反应池内，20‑28℃准确反应25min；
1.3.7在纯水5min、70％、90％、100％乙醇中各2min多次洗涤，让载玻片在空气中自然干燥；
1.3.8每张载玻片以瑞氏染液15‑20滴覆盖，稍等片刻再缓慢地加入瑞氏缓冲液
30‑40滴，以洗耳球轻轻吹打混合染液(勿破坏染液形成地表面张力)，置于室温15min后，用流水轻轻冲洗染片；自然风干后，显微镜下计数观察500个精子。精子晕环越大证明精子质量越好。

[0028] 结果发现，miR‑125a‑5p在高龄小鼠精子中明显高表达(图3)，并且高龄小鼠中精子的DNA损伤明显增加(图4)。

[0029] 实施例2：高龄小鼠胚胎早期发育及miR‑125a‑5p表达情况2.1实验动物：6‑8周龄ICR雌鼠、6‑8周龄ICR雄鼠和13月龄ICR雄鼠均为清洁级，其交配和获取受精卵的策略见图5。因高龄雄鼠和高龄雌鼠交配生产受精卵较少；故将高龄雄鼠和年轻雌鼠交配生产的受精卵定义为高龄胚胎(Aging Group)，将年轻雄鼠和年轻雌鼠交配生产的受精卵定义为年轻胚胎(Young Group)
2.2试剂与耗材准备：
2.2.1 PMSG与HCG配制
使用生理盐水将PMSG和HCG粉剂，按50IU/mL的浓度进行稀释，充分混匀后，按照
1mL/支的剂量，使用0.22mm滤器过滤分装到1.5mL无菌EP管，‑20℃保存，HCG需避光。

[0030] 2.2.2透明质酸酶浓储液用M2培养基将透明质酸酶粉剂稀释成20mg/mL，充分混匀后，使用0.22mm滤器过滤，以200ml/管分装入0.5mL无菌PCR管，‑20℃保存。

[0031] 2.2.3移卵针制备水平持拿玻璃毛细管两端，将管中央部分置于酒精灯火外焰加热，待玻璃管被火焰烧红变软，水平持拿玻璃管稍微离开火焰，双手持拿玻璃毛细管两端，以水平方向反向拉伸，使用砂轮截断中央最细处，将断端在火焰上瞬时灼烧，使断端光滑，体视显微镜下检查无误后，保存备用。

[0032] 2.3小鼠受精卵获取：2.3.1诱导小鼠超促排卵和交配
给予雌鼠腹腔注射PMSG，剂量8IU/只；46‑48h后，再次给予腹腔注射HCG，注射剂量
8IU/只；注射HCG后将雌鼠与公鼠按照1:1比例进行同笼交配(分组：①年轻组：8周龄雌鼠x 
8周龄公鼠；②老龄组：8周龄雌鼠x 13月龄公鼠。次日早晨8:00检查雌鼠阴道栓，出现阴道栓的雌鼠视为交配成功，将其挑选出来，在HCG注射后18h，采集受精卵。

[0033] 2.3.2采集小鼠受精卵将透明质酸酶稀释成1mg/mL和预先将配制好的M2培养基于37℃预热30分钟，将交配成功的雌鼠以颈椎脱臼法处死，解剖腹腔，分离小鼠双侧输卵管，置于预热的M2培养基中，体视显微镜观察下撕裂输卵管壶腹部，可见成团的被颗粒细胞包裹的受精卵流出，使用透明质酸酶消化去除胚胎外周包裹的卵丘颗粒细胞，使用移卵针将去除颗粒细胞的受精卵移入新鲜M2培养液滴清洗3次，洗去残留的透明质；最后将受精卵移入预先制备好的KSOM培养基液滴中，置于5％CO2的37℃培养箱。

[0034] 2.3.4小鼠受精卵体外培养1)制备KSOM培养微滴
①在注射HCG当天晚上，制备培养微滴；
②将KSOM培养基，以30μL/滴的体积排布在35mm平皿底部；
③立即沿侧壁向平皿中滴加组织培养油，滴加的剂量以完全覆盖液滴表面为宜，尽量减少液滴在空气中暴露的时间，在皿底将各液滴标上序号；
④将制备好的培养微滴置于5％CO2的37℃培养箱中过夜，进行温度和气体平衡。

[0035] 2)受精卵体外培养和观察将收集的受精卵按照分组，移入前一天晚上提前制备的培养微滴中进行培养。每个微滴移入20～30枚胚胎，置于5％CO2的37℃培养箱中，进行温度和气体平衡,每个皿做好标记，定时进行观察拍照。

[0036] 2.4微量RNA提取在体视显微镜下，使用口吸管转移体外培养的各组胚胎(桑葚胚期和囊胚期)至RNase‑free的微量离心管中。使用 RNA Isolation Kit提取微量标本的RNA，具体步骤如下：
2.4.1在收集有胚胎的微量离心管中加入50μL的裂解液extraction buffer，置于
42℃水浴30分钟；
2.4.2组装好纯化柱，加入250μL调节缓冲液condition buffer，室温静置5分钟，
16000g离心1分钟，处理好纯化柱；
2.4.3在第1步处理好的裂解液中加入50μL 70％乙醇，上下颠倒混匀，将混悬液移如处理好的纯化柱中，100g离心2分钟，再16000g离心30秒；
2.4.4纯化柱中加入100μL wash buffer 1(W1)，8000g离心1分钟；
2.4.5加入100μL wash buffer 2(W2)，8000g离心1分钟，再加入100μL W2，16000g离心2分钟，再16000g离心1分钟；
2.4.6将纯化柱移入新的0.5mL RNase‑free的微量离心管中，套上除盖的1.5mL EP管，加入11μL RNase‑free水，室温静置2分钟，1000g离心1分钟，再16000g离心1分钟，收集RNA，用于下一步操作。miR‑125a‑5p的反转录和定量参照实施例1。

[0037] 结果发现，高龄胚胎相较于年轻胚胎，其囊胚形成率明显降低(图6、图7)，并且miR‑125a‑5p在高龄胚胎中的表达量明显升高(图8)，提示高龄精子中高表达的miR‑125a‑5p可能在早期胚胎发育中发挥一定的作用。

[0038] 实施例3：年轻小鼠受精卵显微注射miR‑125a‑5p后胚胎早期发育情况及miR‑125a‑5p表达情况
3.1实验动物、试剂耗材准备、小鼠受精卵获取、胚胎体外培养、微量RNA提取、miRNA反转录以及实时荧光定量PCR的实验步骤参考实施例1、实施例2。

[0039] 3.2年轻小鼠受精卵的胞浆显微注射和体外培养3.2.1分组：①年轻组+显微注射miR‑NC；②年轻组+显微注射miR‑125a‑5p mimics；③年轻组+显微注射miR‑125a‑5p/miR‑574mimics；(基于我们前期研究发现miR‑
574也在高龄精子中高表达并影响线粒体功能，故增加③组)
3.2.2配制注射用miR‑NC mimics、miR‑125a‑5p mimics、miR‑125a‑5p/miR‑
574mimics(按照说明书，每0.5OD加入125μl RNase‑free的注射缓冲液，配制浓度为20μM的浓储，之后再取2μL 20μM的浓储稀释成100nM的显微注射液，以10μl/管分装于无RNA酶的PCR管中，以锡箔纸包裹，于‑80℃避光保存待用)。

[0040] 3.2.3小鼠受精卵的胞浆显微注射①取干净的35mm皿，纵行滴加37℃预热的M2培养基，覆盖上组织培养油，置于显微操作仪上的37℃恒温台。

[0041] ②安装持卵针并调试位置。

[0042] ③使用微量上样毛细针吸取3μL显微注射试剂，加入注射针，尽量避免气泡的产生，如产生肉眼可见的气泡，垂直持针，轻弹注射针尾端排出气泡，之后将注射针安装于显微注射操作仪，按“Clean”键，畅通注射针。

[0043] ④将约30枚小鼠受精卵转入注射皿，分批次进行显微注射。在注射系统的高倍视野下，挑选排放了第二极体、具有雌原核和雄原核、形态良好并且折光性好的受精卵，进行显微注射。

[0044] ⑤注射完成后，将注射损伤的胚胎剔除；选择注射成功，并且形态完整的胚胎，用于进一步的体外培养和观察；操作过程使用计时器倒计时，保证在操作过程中，胚胎在培养箱外暴露的时间不超过15min。

[0045] 3.2.4小鼠着床前胚胎的体外培养将显微注射后的胚胎按照分组，移入前一天晚上提前制备的培养微滴中进行培养。每个微滴移入20～30枚胚胎，置于5％CO2的37℃培养箱中，进行温度和气体平衡,每个皿做好标记，定时进行观察拍照。

[0046] 结果发现，年轻小鼠受精卵注射miR‑125a‑5p后其囊胚形成率明显降低，注射miR‑125a‑5p/miR‑574混合物后其囊胚形成率进一步降低(图9)；并且miR‑125a‑5p在注射miR‑
125a‑5p、miR‑125a‑5p/miR‑574混合物的胚胎中明显高表达(图10)。提示miR‑125a‑5p可影响胚胎的早期发育，miR‑125a‑5p表达越高，胚胎囊胚形成率降低。

[0047] 实施例4：miR‑125a‑5p抑制剂改善高龄胚胎早期发育效果探究4.1实验动物、试剂耗材准备、小鼠受精卵获取、显微注射、胚胎体外培养的实验步骤参考实施例2、实施例3。

[0048] 4.2高龄小鼠受精卵的胞浆显微注射和体外培养4.2.1分组：①年轻组；②高龄组；③高龄组+显微注射miR‑125a‑5p inhibitor。

[0049] 4.2.2配制注射用miR‑NC inhibitor和miR‑125a‑5p inhibitor(按照说明书，每0.5OD加入125μl RNase‑free的注射缓冲液，配制浓度为20μM的浓储，之后再取2μl 20μM的浓储稀释成2μM的显微注射液，以10μl/管分装于无RNA酶的PCR管中，以锡箔纸包裹，于‑80℃避光保存待用)。

[0050] 4.2.3其余步骤同实施例3所述。

[0051] 结果发现，高龄小鼠受精卵的囊胚形成率明显下降；高龄小鼠受精卵注射了miR‑125a‑5p inhibitor后其桑椹胚、囊胚形成率明显改善(图11、图12)。提示miR‑125a‑5p抑制剂可用于改善高龄胚胎早期发育效果。