技术领域
[0001] 本实用新型属于生物技术领域，尤其涉及鸡DKK1基因表达荧光定量RT‑PCR试剂盒及检测方法，主要用于鸡DKK1基因表达调控和鸡生长发育相关的功能研究。
相关背景技术
[0002] DKK1是Dickkopf家族的重要成员，在哺乳动物中序列高度保守，是一种分泌型糖蛋白，能够与膜上的Wnt受体LRP结合，也可以与KRM和LRP形成三元复合物，使得下游的β‑catenin蛋白降解，进而抑制下游信号通路的激活。DKK1作为Wnt信号通路的抑制剂，参与骨骼发育，脂肪沉积，血管生成，毛发再生等多个生物学过程。DKK1在动物的生长发育中具有重要的作用，能够与多种信号通路如FGF、BMP等通路相互作用，调控相关基因的表达，进而对动物的表型性状产生重要影响。Wnt信号通路同样在鸡皮肤毛囊、肌肉生长发育中具有重要的作用。DKK1作为经典的Wnt信号通路的抑制剂，能够通过激活其他信号通路在动物生长发育扮演重要角色。DKK1基因在鸡生长发育中的作用与其表达量密切相关，但关于DKK1基因表达量的高低，及调控机制尚不明确。研究DKK1在鸡生长发育过程中的表达变化，有助于研究人员深入了解DKK1在鸡生长发育过程中的功能及调控模式。实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃，运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析。实用新型内容
[0003] 本实用新型提供一种鸡DKK1基因表达荧光定量RT‑PCR检测试剂盒，本实用新型试剂盒准确性高、快速、价格低廉，通过建立实时荧光定量RT‑PCR技术检测鸡DKK1基因表达的方法，为研究鸡DKK1表达调控以及在鸡生长发育中的调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。
[0004] 本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，鸡DKK1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒，包括盒体、盒盖，盒体内包括DNA双链嵌合绿色染料(SYBR Green Master)热启动荧光PCR 混合物、鸡DKK1基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因β‑actin表达的特异性正反向引物、定量PCR参比染料(ROX)、灭菌无核酸酶水(DEPC)；
[0005] 所述盒体内壁上部均匀设有若干个周向设置的L形槽；
[0006] 所述盒盖为台阶结构，盒盖下部直径小于盒盖上部直径，盒盖下部外侧壁上周向均匀分布若干个锁紧件，锁紧件对应放入盒体的L形槽竖直部中，下移盒体至L形槽竖直部底，之后旋转盒盖，使得锁紧件进入L形槽水平部，实现盒体和盒盖的锁紧。
[0007] 其中，鸡DKK1基因正反向引物序列为：
[0008] F:5，—CGGAGCAGAAGGTTGTTT—3，
[0009] R:5，—GGCTCACTCAGAACGTCTGTA—3；
[0010] 以及鸡内参基因β‑actin表达的特异性正反向引物序列为:
[0011] F:5，—TGCTGTGTTCCCATCTATCG—3，
[0012] R:5,—TTGGTGACAATACCGTGTTCA—3。
[0013] 优选的，所述试剂盒为圆柱形结构，盒体、盒盖的材质为塑料。
[0014] 优选的，所述盒体上设有下凸出部，下凸出部上设有按钮，按钮可相对于下凸出部上下移动；
[0015] 所述盒盖上部设有上凸出部，上凸出部上设有轴向槽，轴向槽与按钮相配合；
[0016] 当盒体和盒盖锁紧后，锁紧按钮伸入轴向槽内，防止盒体、盒盖旋松。
[0017] 优选的，所述下凸出部内设有按钮安装槽，按钮安装槽中部的宽度大于按钮安装槽上下端的宽度；
[0018] 所述按钮为十字形结构，按钮两侧的翅片位于按钮安装槽中部内，按钮下部穿套有弹簧。
[0019] 优选的，所述盒体内设有衬垫，衬垫上设有试剂容纳腔。
[0020] 上述鸡DKK1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒的使用方法如下：
[0021] (1)组织RNA的抽提与纯化：从鸡皮肤组织中提取总RNA并纯化；
[0022] (2)cDNA第一链的合成：以步骤(1)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；
[0023] (3)荧光定量real time PCR扩增反应：采用DNA双链嵌合绿色荧光染料(SYBR Green) 染料法，以上述(1)设计的DKK1正反向引物和β‑actin基因正反向引物和(2)合成的cDNA 第一链为模板，在荧光定量PCR仪上进行；
[0024] 本实用新型所述步骤(3)中实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增的反应条件设置如下：
[0025] 94℃预变性10min；然后40个循环的94℃变性30s,退火60℃ 30s,72℃ 30s；最后 94℃ 30s,60℃ 30s,94℃ 30s。
[0026] 鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，对DKK1和β‑actin基因基因按照设定好的条件同时进行荧光定量PCR(real time PCR)反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β‑actin基因为内参照，对DKK1基因mRNA表达水平进行校正，并采用2‑ΔΔCT法对数据进行处理，计算DKK1基因相对表达量。
[0027] 与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
[0028] 第一，本实用新型DKK1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒及其检测方法，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、自动化程度高，无污染、实时性好等优点。
[0029] 第二，本实用新型在对盒体和盒盖的连接结构进行改进，在盒体上部内壁周向布置L形槽，在盒盖外壁上周向布置锁紧件，锁紧件对应放入盒体的L形槽竖直部中，下移盒体至L 形槽竖直部底，之后旋转盒盖，使得锁紧件进入L形槽水平部，实现盒体和盒盖的锁紧。
[0030] 第三，本实用新型设计了按钮和轴向槽结构，防止盒体盒盖旋送，防止锁紧件从L形槽中脱离。按压按钮，实现盒体和盒盖的锁紧；当盒体和盒盖锁紧时，松开按钮，在弹簧的作用下，按钮上部进入轴向槽，防止盒体、盒盖旋松；向下按压按钮，旋转并上移盒盖，使得盒盖、盒体相分离。
具体实施方式
[0040] 结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。
[0041] 如图1‑6所示，一种DKK1基因荧光定量RT‑PCR试剂盒，包括盒体1、盒盖2。盒体1 内设有衬垫，衬垫上设有5个试剂容纳腔3。5个试剂容纳腔3内分别放置DNA双链嵌合绿色染料(SYBR Green Master)热启动荧光PCR混合物4、鸡DKK1基因表达的特异性正反向引物5、定量PCR参比染料(Rox)6，鸡内参基因β‑actin表达的特异性正反向引物7、灭菌无核酸酶水(DEPC)8。
[0042] 其中，鸡DKK1基因正反向引物序列为：
[0043] F:5，—CGGAGCAGAAGGTTGTTT—3，
[0044] R:5，—GGCTCACTCAGAACGTCTGTA—3；
[0045] 鸡内参基因β‑actin表达的特异性正反向引物序列为:
[0046] F:5，—TGCTGTGTTCCCATCTATCG—3，
[0047] R:5,—TTGGTGACAATACCGTGTTCA—3。
[0048] 试剂盒为圆柱形结构，盒体1、盒盖2的材质为塑料。
[0049] 盒体1内壁上部均匀设有若干个周向设置的L形槽12。
[0050] 盒盖2为台阶结构，盒盖2下部直径小于盒盖2上部直径，盒盖2下部外侧壁上周向均匀分布若干个锁紧件9，锁紧件9对应放入盒体的L形槽12竖直部121中，下移盒体至L形槽12竖直部底，之后旋转盒盖2，使得锁紧件9进入L形槽12水平部122，实现盒体1和盒盖2的锁紧。
[0051] 盒体1上设有下凸出部13，下凸出部13上设有按钮14，按钮14可相对于下凸出部13 上下移动。
[0052] 盒盖2上部设有上凸出部10，上凸出部10上设有轴向槽11，轴向槽11与按钮14相配合；
[0053] 当盒体1和盒盖2锁紧后，锁紧按钮14伸入轴向槽11内，防止盒体1、盒盖2旋松。
[0054] 下凸出部13内设有按钮安装槽16，按钮安装槽16中部的宽度大于按钮安装槽16上下端的宽度。
[0055] 按钮14为十字形结构，按钮14两侧的翅片位于按钮安装槽16中部内，按钮14下部穿套有弹簧15。
[0056] 当盒体1和盒盖2锁紧时，按钮14处于自由状态，在弹簧15的作用下，按钮14上部进入轴向槽11，防止盒体1、盒盖2旋松。向下按压按钮14，旋转并上移盒盖2，使得盒盖、盒体相分离。
[0057] 实施例：DKK1基因在鸡不同发育阶段皮肤组织中的差异表达量分析[0058] 以自主培育的花山麻鸡为素材，运用本实用对不同发育阶段的鸡不同部位皮肤组织的 DKK1基因进行定量检测。
[0059] 采集0、1、3、5、7、9周龄各个发育时期的鸡背部和腿部皮肤组织样品置于液氮速冻后转入‑80℃冰箱保存；采用总RNA提取试剂(Trizol)裂解法，从采集到的皮肤样本中提取总 RNA，以提取的总RNA为模板，按照RT‑PCR试剂盒[宝生物，大连，中国(Takara,Dalian,China)] 说明书反转录合成cDNA第一链。
[0060] 荧光定量PCR(real time PCR)扩增反应：采用DNA双链嵌合绿色荧光染料I(SYBR Green I)染料法，以上述合成的cDNA第一链为模板，设计的DKK1正反向引物(5)和β‑actin基因正反向引物(6)，在Max3000P荧光定量PCR仪(爱普拜斯)上进行。即鸡各组织样本总RNA反转录成cDNA第一链后，分别配置DKK1和β‑actin基因各自进行荧光定量PCR (real‑time PCR)扩增所需的反应体系，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。
[0061] 荧光定量PCR扩增体系配制如下表：
[0062] 表1荧光定量PCR扩增体系
[0063]
[0064] 将每个样本的2个基因的扩增体系同时放入荧光定量PCR仪，进行PCR反应，实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增的反应条件设置如下：
[0065] 94℃预变性10min；然后40个循环的94℃变性30s,退火60℃ 30s,72℃ 30s；最后 94℃ 30s,60℃ 30s,94℃ 30s。
[0066] 每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β‑actin基因为内参‑ΔΔCt对照，对DKK1基因mRNA表达水平进行校正，并采用2 法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct 目的基因‑Ct内参基因)，以一个时间点为对照，计算不同发育时期皮肤组织中DKK1基因的相对表达量。结果见图7。
[0067] 由图7可以看出，0日龄至1周龄时，DKK1的表达量较低，3周龄时，表达量升至最高， 5周龄时，表达量显著下调。7周龄时，背部组织DKK1的表达量再次显著升高，但腿部皮肤组织的表达量并未出现升高的现象。9周龄时，背部和腿部皮肤组织表达量维持在相对较低的水平，与7周龄无显著差异。不同部位组织间比较，各个发育时期，3周龄、7周龄和9 周龄时，DKK1基因mRNA表达在背部和腿部皮肤组织呈显著差异(P<0.05)。说明DKK1 基因可能在鸡皮肤毛囊早期生长发育中具有重要作用。
[0068] 本实用新型用实时荧光定量RT‑PCR技术检测鸡DKK1基因表达的方法，为研究鸡DKK1 表达调控以及在组织发育中的作用奠定基础，为优质肉鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。
