[0001] 本实用新型涉及一种检测不同性别绵羊羊羔生长性状的试剂盒。

[0002] 脂联素(Adiponectin，ADIPOQ)是一种脂肪细胞因子家族中的一员，在机体能量储存、糖类代谢和脂肪代谢中具有十分重要的作用。最初检测到其主要在白色脂肪组织中表达，但目前发现其在其它诸如棕色脂肪组织、骨髓、肝脏和骨骼肌中均有表达。

[0003] ADIPOQ基因最早定位于人类染色体3q27处，且已被标记与肥胖、身体质量指数和生长性状具有重要作用的潜在QTL遗传位点。该基因分子全长约17kbp，包含3个外显子和2个内含子，其CDs区共编码247个氨基酸(第1外显子，部分第2外显子和第5外显子不参与编码氨基酸)。研究发现，在人类ADIPOQ基因中的部分单核苷酸突变与肥胖、 II类糖尿病、癌症、血清脂联素水平和肺慢性阻塞性疾病具有显著关联性。

[0004] 在家畜动物中，ADIPOQ基因多态性与多种生产性状具有相关性，诸如与马的肥胖度，山羊的胸围，猪的脂肪沉积及其它多种胴体生产性能，牛的眼肌面积、大理石花纹及胴体脂肪厚度均具有一定关联性。

[0005] 目前，ADIPOQ基因作为一种与家畜生产性能相关的候选基因在国内外被广泛研究，并在提高生产性能育种改良方面加以应用。不同性别绵羊生长性状相关基因分子标记选种技术基于PCR-SSCP技术对待测绵羊ADIPOQ基因启动子区进行核苷酸突变检测分析，再根据检测结果判定不同性别携带不同等位基因绵羊的生长性状，筛选优良群体，从而有效筛选因性别差异导致的绵羊生长性状差异的评估机理，提高绵羊的个体经济效益、加快绵羊育种改良进程。

[0006] 上述检测过程需要使用多种试剂，因此很需要有一种试剂盒，能够将试剂瓶及主要辅助检测用品集装在一个盒中作为一个单元取用，检测者使用时只需取一次盒即可实施操作，使用完可以存回原盒送检，这将是很方便之举，同时这样也可避免造成二次污染。实用新型内容

[0007] 本实用新型的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种检测不同性别绵羊羊羔生长性状的试剂盒，该试剂盒用于不同性别绵羊羊羔生长性状相关基因分子选种技术，将检测过程中所使用的多种试剂存放在一起，使用方便，能够避免造成二次污染。

[0008] 本实用新型提供一种检测不同性别绵羊羊羔生长性状的试剂盒，所述试剂盒包括盒盖、盒体和置于盒体内部的衬垫，所述衬垫分为上下两层，分别为上衬垫和下衬垫；

[0009] 所述上衬垫上设有两排，两排之间设有凹槽一，在上衬垫第一排一侧设有六个容器孔，分别为容器孔一、容器孔二、容器孔三、容器孔四、容器孔五、容器孔六，在上衬垫第一排另一侧设有一个长方体型容器孔；

[0010] 在上衬垫第二排设有四个容器孔，分别为容器孔七、容器孔八、容器孔九和容器孔十；

[0011] 所述下衬垫上设有两排，两排之间设有凹槽二，在下衬垫第一排设有四个容器孔，分别为容器孔十一、容器孔十二、容器孔十三和容器孔十四；

[0012] 在下衬垫第二排一侧设有四个容器孔，分别为容器孔十五、容器孔十六、容器孔十七、容器孔十八，在下衬垫第二排另一侧设有容器孔十九。

[0013] 作为优选，所述上衬垫和下衬垫的厚度均在4厘米以上。

[0014] 作为优选，所述上衬垫和下衬垫的厚度均在7厘米以下。

[0015] 作为优选，在上衬垫第一排一侧设有三列大小一致、平行且均匀排布的容器孔，每列有两个容器孔，分别为容器孔一、容器孔二、容器孔三、容器孔四、容器孔五、容器孔六。

[0016] 作为优选，在上衬垫第二排横向设有大小一致且均匀排布的四个容器孔，分别为容器孔七、容器孔八、容器孔九和容器孔十。

[0017] 作为优选，在下衬垫第一排横向设有大小一致且均匀排布的四个容器孔，分别为容器孔十一、容器孔十二、容器孔十三和容器孔十四。

[0018] 作为优选，在所述容器孔十一、容器孔十二、容器孔十三和容器孔十四之间，容器孔相邻边缘的间距大于2厘米，小于4厘米。

[0019] 作为优选，在下衬垫第二排一侧设有两列大小一致、平行且均匀排布的容器孔，每列有两个容器孔，分别为容器孔十五、容器孔十六、容器孔十七、容器孔十八。

[0020] 作为优选，在所述容器孔十五、容器孔十六、容器孔十七、容器孔十八之间，容器孔相邻边缘的间距大于1.5厘米，小于3厘米。

[0021] 作为优选，所述容器孔十一的直径小于容器孔十九的直径。

[0022] 作为优选，所述容器孔十一的直径大于容器孔十五、容器孔七或容器孔一的直径。

[0023] 本实用新型的试剂盒将检测过程中所使用的多种试剂存放在一起，使用方便，能够避免造成二次污染，设计合理，取用方便。上衬垫中放置的为PCR扩增时使用的试剂，下衬垫中放置的为SSCP时使用的试剂，取用时不容易混淆。

[0028] 以下的实施例便于更好地理解本实用新型，但并不限定本实用新型。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

[0029] 实施例1

[0030] 1、试验材料

[0031] 试验所用1087只罗姆尼羊羊羔均来自于同一牧场的17只优质种公羊的子一代，收集具有完整生长性状指标(性别，初生重，断尾重，断奶重并计算断奶前生长速度)的羊只 DNA血样，采用NaOH两步法提取绵羊基因组DNA。

[0032] 2、引物设计和PCR扩增

[0033] 参考Genbank公布的ADIPOQ基因参考序列(登录号NC-019458.1)，应用Primer 5.0 在线设计特异性引物，对绵羊ADIPOQ基因启动子区进行扩增。引物序列为：

[0034] ADIPOQ-F：5’-TTCCTGCTTCTGATCTTGACC-3’；

[0035] ADIPOQ-R：5’-CAGCCTAGAAATTGAATCAGTC-3’。

[0036] PCR反应体系为：

[0037] 总体积20μL，10×buffer缓冲液2μL，5×Q溶液2μL，3μM MgCl2 1.2μL，150μM dNTPs1.2μL，0.25μM上下游混合引物1μL，0.5U Taq聚合酶0.1μL，一个承载有绵羊基因组DNA的1.2mm滤纸小圆盘和12.5μL的ddH2O。

[0038] PCR扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30 秒，共37个循环，最后延伸5分钟，得到约372bp大小的PCR产物。

[0039] 3、PCR产物的SSCP检测

[0040] 为保证检测样本等位基因结果的准确性，将等位基因标准DNA样本与待测样本同时进行SSCP电泳，参照标准等位基因DNA样本(等位基因*A、等位基因*B、等位基因*C 和等位基因*D)判定待测样本等位基因类型。4种标准等位基因的核苷酸序列分别为：

[0041] 等位基因*A的标准DNA样的核苷酸序列为：

[0042] TTCCTGCTTC TGATCTTGAC CCTTGGTCCC ATCTTCTGTT GCTGTTGTAA

[0043] GAGGCAAAAA TAAAGGCCAA AGCCTGGAGA CATAAGTGTG ATGCCTGCAG

[0044] CTCTACTTGG CATCCTAAGC CCGAATTGGG TTGCACCAGG TTCCCTCGGG

[0045] TGGCAACCCA AGGGAGCTGC CAGGGGCTGT GTCTACCCAT TGGTCTCTGG

[0046] TTCTCACTGT GCTGGCCAAT GGGAAGGGAC AGTGGTGAGG CGGGGTCTGC

[0047] TTACCCCCAT GAGTACCGGG CCACTGAGGC CAGGCCATCG CCTCTTACTT

[0048] CCACACTGAC CGAAGTCTGT GGCTCTGATT CCACACCTGA GGGTAAGGAT

[0049] GACTGATTCA ATTTCTAGGC TG

[0050] 等位基因*B的标准DNA样的核苷酸序列为：

[0051] TTCCTGCTTC TGATCTTGAC CCTTGGTCCC ATCTTCTGTT GCTGTTGTAA

[0052] GAGGCAAAAA TAAAGGCCAA AGCCTGGAGA CGTAAGTGTG ATGCCTGCAG

[0053] CTCTACTTGG CATCCTAAGC CCTAATTGGG TTGCACCAGG TTCCCTCGGG

[0054] TGGCAACCCA AGGGAGCTGC CAGGGGCTGT GTCTACCCAT TGGTCTCTGG

[0055] TTCTCACTGT GCTGGCCAAT GGGAAGGGAC AGTGGTGAGG CGGGGTCTGC

[0056] TTACCCCCAT GAGTACCGGG CCGCTGAGGC TGGGCCATCG CCTCTTACTT

[0057] CCACACTGAC CGAAGTCTGT GGCTCTGATT CCACACCTGA GGGTAAGGAT

[0058] GACTGATTCA ATTTCTAGGC TG

[0059] 对绵羊羊羔生长性状无影响的等位基因*C核苷酸序列为：

[0060] TTCCTGCTTC TGATCTTGAC CCTTGGTCCC ATCTTCTGTT GCTGTTGTAA

[0061] GAGGCAAAAA TAAAGGCCAA AGCCTGGAGA CATAAGTGTG ATGCCTGCAG

[0062] CTCTACTTGG CATCCTAAGC CCGAATTGGG TTGCACCAGG TTCCCTCGGG

[0063] TGGCAACCCA AGGGAGCTGC CAGGGGCTGT GTCTACCCAT TGGTCTCTGG

[0064] TTCTCACTGT GCTGGCCAAT GGGAAGGGAC AGTGGTGAGG CGGGGTCTGC

[0065] TTACCCCCAT GAGTACCGAG CCACTGAGGC CAGGCCATCG CCTCTTACTT

[0066] CCACACTGAC CGAAGTCTGT GGCTCTGATT CCACACCTGA GGGTAAGGAT

[0067] GACTGATTCA ATTTCTAGGC TG

[0068] 对绵羊羊羔生长性状无影响的等位基因*D核苷酸序列为：

[0069] TTCCTGCTTC TGATCTTGAC CCTTGGTCCC ATCTTCTGTT GCTGTTGTAA

[0070] GAGGCAAAAA TAAAGGCCAA AGCCTGGAGA CATAAGTGTG ATGCCTGCAG

[0071] CTCTACTTGG CATCCTAAGC CTGAATTGGG TTGCACCAGG TTCCCTCGGG

[0072] TGGCAACCCA AGGGAGCTGC CAGGGGCTGT GTCTACCCAT TGGTCTCTGG

[0073] TTCTCACTGT GCTGGCCAAT GGGAAGGGAC AGTGGTGAGG CGGGGTCTGC

[0074] TTACCCCCAT GAGTACCGGG CCACTGAGGC CAGGCCATCG CCTCTTACTT

[0075] CCACACTGAC CGAAGTCTGT GGCTCTGATT CCACACCTGA GGGTAAGGAT

[0076] GACTGATTCA ATTTCTAGGC TG

[0077] 等位基因之间的核苷酸差异见表1。

[0078] 表1绵羊ADIPOQ等位基因核苷酸变异

[0079]

[0080] SSCP电泳方法为：

[0081] 在20μL的PCR工作产物中加入100μL的SSCP上样变性缓冲液(98％去离子甲酰胺、 10mMEDTA、0.025％溴酚蓝和0.025％二甲苯青)。105℃热变性5分钟后立即置于冰水混合物中，然后将10μL变性产物上样于16×18cm的14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Arc： Bis＝37.5:
1)中，在300V电压，0.5倍TBE，17℃电泳槽中电泳19h。银染显色后判型、拍照并干燥保存。

[0082] 4、克隆、测序判定等位基因序列

[0083] 根据SSCP检测结果，选取不同基因型的个体利用纯化试剂盒纯化后测序；对所检测到的等位基因只存在于杂合子中的PCR产物，进行克隆纯化后送华大生物公司进行测序。测定结果通过MegAlign软件与等位基因标准DNA核苷酸序列(等位基因*A、等位基因 *B、等位基因*C和等位基因*D)进行比对。

[0084] 5、数据分析

[0085] 应用MINTAB(Version 16)一般线性混合效应模型(General Liner Mixed-effect Models， GLMMs)评估特定等位基因的存在/缺失对生长性状的影响。

[0086] 对某一特定基因性状进行存在(1)缺失(0)分析模型中，等位基因、家系影响、出生等级为固定因素，遵从下列模型进行最小二乘方差分析：

[0087] Yijknm＝μ+Gi+Cj+Mk+Fm+Xn+eijknm

[0088] 其中，Y为相应性状，μ为群体均值，Gi为家系效应，Cj为性别效应，Mk为出生等级效应/初生重(取决于谁对模型更具影响力)，Fm等位基因效应，Xn为因素间互作效应， eijknm为随机误差。

[0089] 6、绵羊ADIPOQ基因启动子区变异与不同性别绵羊生长性状关联性分析[0090] 在ADIPOQ基因启动子区上鉴定出4条等位基因链(A、B、C和D)，但是等位基因C和D在新西兰罗姆尼羊中的被检出率很小，频率低于5％，建议不做分析，因此，只对等位基因A和B进行性别差异的生长性状相关性分析。

[0091] 对具有完整数据及等位基因特征的550只公羔和537只母羔样本进行等位基因存在与缺失分析，结果表明，公羔中存在等位基因*A的群体具有较低的断尾重(P＝0.019)，断奶重(P＝0.017)和断奶前生长速度(P＝0.025)，等位基因*B未发现与公羔生长性状有显著相关性。在母羔中存在等位基因*A的群体未发现与生长性状有显著相关性，但发现存在等位基因*B的母羔具有较高的断尾重(P＝0.019)；多因素矫正以上结果亦均有显著相关性(P<0.05)；结果见表2。

[0092] 根据上述分析鉴定结果，实际生产中若需有效提高绵羊生长性能，建议选留缺失等位基因*A的公羔群体和携带等位基因*B的母羔群体，淘汰携带等位基因*A的公羔群体可有改善绵羊后台群体的生长性能，同时等位基因*B也可参考作为绵羊生长性能的基因标记。

[0093] 表2 ADIPOQ基因等位基因与罗姆尼公/母羔羊生长性状关联性分析

[0094]

[0095] 实施例2

[0096] 如图1-3所示，本实用新型的与不同性别绵羊羊羔生长性状相关的PCR-SSCR试剂盒包括盒盖1、盒体2和置于盒体内部的衬垫，盒盖1和盒体2可以是活动连接，也可以是扣合。衬垫分为上下两层，分别为上衬垫3和下衬垫4。

[0097] 上衬垫3和下衬垫4的厚度均在4厘米以上，这样能够确保为各个试剂提供足够的缓冲力，优选厚度为小于7厘米，以免浪费材料。衬垫的材质为海绵或泡沫。

[0098] 上衬垫3上设有两排，排与排之间设有凹槽一5，用于放置冰块。

[0099] 在上衬垫3第一排一侧设有三列大小一致、平行且均匀排布的容器孔，每列有两个容器孔，分别为容器孔一8、容器孔二9、容器孔三10、容器孔四11、容器孔五12、容器孔六13，为了获得足够的缓冲力，六个容器孔相邻边缘的间距大于1.5厘米，为了节省材料，间距最好小于3厘米。

[0100] 在上衬垫3第一排另一侧设有一个长方体型容器孔7，大小与血样DNA承载滤纸相适应。

[0101] 在上衬垫3第二排横向设有大小一致且均匀排布的四个容器孔，分别为容器孔七14、容器孔八15、容器孔九16和容器孔十17。为了获得足够的缓冲力，容器孔相邻边缘的间距大于1.5厘米，为了节省材料，间距最好小于3厘米。

[0102] 下衬垫4上设有两排，排与排之间设有凹槽二6，用于放置冰块。

[0103] 在下衬垫4第一排横向设有大小一致且均匀排布的四个容器孔，分别为容器孔十一 23、容器孔十二24、容器孔十三25和容器孔十四26。为了获得足够的缓冲力，容器孔相邻边缘的间距大于2厘米，为了节省材料，间距最好小于4厘米。

[0104] 在下衬垫4第二排一侧设有两列大小一致、平行且均匀排布的容器孔，每列有两个容器孔，分别为容器孔十五18、容器孔十六19、容器孔十七20、容器孔十八21，在第一排另一侧设有一个容器孔十九22。为了获得足够的缓冲力，容器孔相邻边缘的间距大于1.5 厘米，为了节省材料，间距最好小于3厘米。

[0105] 其中，容器孔十一23的直径比容器孔十九22的直径小，但是比容器孔十五18、容器孔七14以及容器孔一8的直径大。

[0106] 凹槽一5和凹槽二6的深度一致，均在衬垫厚度的1/2-2/3之间。该深度的设置，使得在其中放入冰块时，能够更好的降低各个试剂的温度，且在运输时，凹槽底部的衬垫具有足够的缓冲作用，确保冰块不会穿透衬垫而到达试剂盒内侧底部。

[0107] 上衬垫3上，容器孔一8、容器孔二9、容器孔三10、容器孔四11、容器孔五12、容器孔六13中分别放置10×Buffer缓冲液，5×Q缓冲液，MgCl2溶液，dNTPs溶液，上下游混合引物和Taq聚合酶；长方体型容器孔7中放置血样DNA承载滤纸；容器孔七14、容器孔八15、容器孔九16和容器孔十17分别放置标准等位基因DNA样本ADIPOQ*A、 ADIPOQ*B、ADIPOQ*C和ADIPOQ*D。

[0108] 下衬垫4上，容器孔十一23、容器孔十二24、容器孔十三25和容器孔十四26分别放置TEMED溶液，40％PA溶液，10×TBE溶液和10％APS溶液；容器孔十五18、容器孔十六19、容器孔十七20、容器孔十八21分别放置98％去离子甲酰胺溶液，10mM的 EDTA溶液，0.025％二甲苯青溶液和溴酚蓝溶液；容器孔十九22放置去离子水。

[0109] 最后应说明的是：以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限制本实用新型，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。