[0001] 本实用新型属于生物技术领域，尤其涉及鸡Wnt3a基因表达荧光定量RT-PCR试剂盒，主要用于鸡Wnt3a基因表达调控和皮肤毛囊发育相关的功能研究。

[0002] Wnt信号通路在动物的生长发育中扮演着多种关键角色，如神经系统发育、骨骼肌发育、皮肤毛囊的生长发育等。Wnt3a基因是Wnt信号通路的重要成员，被认为在毛囊的形态发生、发育、分布及生长周期中起着至关重要的作用。Wnt3a能够促进生黑色素细胞增殖和分化，在皮肤颜色变黑方面起重要的作用，同时在毛囊的不同的发育阶段起重要作用。肤色和毛囊密度的大小作为鸡的重要经济性状，是肉鸡产业关注的重要性状之一。研究Wnt3a基因的表达调控对于了解鸡皮肤毛囊的生长发育调控机理具有重要意义。实用新型内容

[0003] 为了解决以上技术问题，本实用新型提供一种鸡Wnt3a基因表达荧光定量RT-PCR检测试剂盒，本实用新型试剂盒准确性高、快速、价格低廉，通过本实用新型建立实时荧光定量 RT-PCR技术检测鸡Wnt3a基因表达的方法，为研究鸡Wnt3a表达调控以及皮肤毛囊生长发育调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。

[0004] 本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，鸡Wnt3a基因荧光定量RT-PCR试剂盒，包括盒体，盒体内设有DNA双链嵌合绿色染料(SYBR Green Master)热启动荧光PCR混合物、鸡Wnt3a基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物、定量PCR参比染料(ROX)、灭菌无核酸酶水(DEPC)。

[0005] 其中，鸡Wnt3a基因表达的特异性正反向引物为：

[0006] F:5，—ACTGAGAAGGACCTGGTTT—3，

[0007] R:5，—ATGGGAAGTGACGTTACAGA—3；

[0008] 以及鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物序列为:

[0009] F:5，—TGCTGTGTTCCCATCTATCG—3，

[0010] R:5,—TTGGTGACAATACCGTGTTCA—3。

[0011] 优选的，试剂盒还包括盒盖，盒盖与盒体螺纹连接。

[0012] 优选的，所述盒体内设有若干个容纳腔，容纳腔中对应设置DNA双链嵌合绿色染料 (SYBR Green Master)热启动荧光PCR混合物、鸡Wnt3a基因表达的特异性正反向引物、定量PCR参比染料(Rox)、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物、灭菌无核酸酶水(DEPC)对应的试剂管；

[0013] 所述容纳腔的内壁上设有定位槽组，包括第一定位槽、第二定位槽，第一定位槽沿容纳腔轴向设置，第二定位槽沿容纳腔周向设置，第一定位槽、第二定位槽相连通；试剂管上设有定位凸起，定位凸起分别与第一定位槽、第二定位槽相配合。

[0014] 优选的，所述容纳腔的内壁上设有两个定位槽组，两个定位槽组呈中心对称结构；所述试剂管上设有2个定位凸起，2个定位凸起对称设置。

[0015] 优选的，所述第一定位槽、第二定位槽组成L形结构。

[0016] 上述鸡Wnt3a基因荧光定量RT-PCR试剂盒的使用方法如下：

[0017] (1)组织RNA的抽提与纯化：从鸡组织中提取总RNA并纯化；

[0018] (2)cDNA第一链的合成：以步骤(1)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

[0019] (3)实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增反应：采用DNA双链嵌合绿色荧光染料法(SYBR Green)，以上述步骤(1)设计的鸡Wnt3a基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物和步骤(2)合成的cDNA第一链为模板，在荧光定量 PCR仪上进行；

[0020] 步骤(3)中实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增的反应条件设置如下：

[0021] 95℃预变性15min；然后40个循环的95℃变性30s,退火60℃ 30s,72℃ 30s；最后 95℃ 30s,60℃ 30s,95℃ 30s。

[0022] 鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，对Wnt3a和β-actin基因基因按照设定好的条件同时进行实时荧光定量PCR(real time PCR)反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β-actin基因为内参照，对Wnt3a基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔCT法对数据进行处理，计算Wnt3a基因相对表达量。

[0023] 与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：

[0024] 第一，利用本实用新型Wnt3a基因荧光定量RT-PCR试剂盒进行检测，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、自动化程度高，无污染、实时性好等优点。

[0025] 第二，Wnt3a基因在鸡皮肤毛囊生长发育中的作用与其表达量密切相关。实时荧光定量 PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)相结合使定量极微量的基因表达成为可能，能够广泛用于基因表达、基因功能等方面研究。

[0026] 第三，本实用新型在容纳腔内设计第一定位槽、第二定位槽，在试剂管上设置定位凸起，使用时，将定位凸起对准第一定位槽，将试剂管插入容纳腔内，使得试剂管及定位凸起沿着第一定位槽下移至最低处，然后转动试剂管，使得定位凸块在第二定位槽内平移，进而从轴向、周向两个方向对试剂管进行定位，防止试剂管在容纳腔内随意移动，保证运输安全。

[0035] 结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。

[0036] 实施例：Wnt3a基因在鸡不同发育阶段皮肤组织中的差异表达量分析[0037] 如图1-5所示，一种鸡Wnt3a基因荧光定量RT-PCR试剂盒，包括盒体4，盒体4内设有 DNA双链嵌合绿色染料(SYBR Green Master)热启动荧光PCR混合物3、鸡Wnt3a基因表达的特异性正反向引物5、定量PCR参比染料(Rox)6、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物7、灭菌无核酸酶水(DEPC)8。

[0038] 其中，鸡Wnt3a基因表达的特异性正反向引物5序列为：

[0039] F:5，—ACTGAGAAGGACCTGGTTT—3，

[0040] R:5，—ATGGGAAGTGACGTTACAGA—3；

[0041] 鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物7序列为:

[0042] F:5，—TGCTGTGTTCCCATCTATCG—3，

[0043] R:5,—TTGGTGACAATACCGTGTTCA—3。

[0044] 试剂盒还包括盒盖1，盒盖1与盒体4螺纹连接。盒盖1与盒体4还可以采用铰连结构、卡扣结构等现有连接结构。

[0045] 盒体4内设有若干个容纳腔2，容纳腔2中对应设置DNA双链嵌合绿色染料(SYBR Green Master)热启动荧光PCR混合物3、鸡Wnt3a基因表达的特异性正反向引物5、定量PCR参比染料(Rox)6、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物7、灭菌无核酸酶水(DEPC) 8对应的试剂管9。

[0046] 容纳腔2的内壁上设有定位槽组，包括第一定位槽21、第二定位槽22，第一定位槽21 沿容纳腔2轴向设置，第二定位槽22沿容纳腔2周向设置，第一定位槽21、第二定位槽22 相连通。第一定位槽21、第二定位槽22组成L形结构。

[0047] 试剂管9上设有定位凸起91，定位凸起91分别与第一定位槽21、第二定位槽22相配合。

[0048] 容纳腔2的内壁上设有两个定位槽组，两个定位槽组呈中心对称结构；试剂管9上设有 2个定位凸起91，2个定位凸起91对称设置。

[0049] 本实用新型在容纳腔内设计第一定位槽、第二定位槽，在试剂管上设置定位凸起，使用时，将定位凸起对准第一定位槽，将试剂管插入容纳腔内，使得试剂管及定位凸起沿着第一定位槽下移至最低处，然后转动试剂管，使得定位凸块在第二定位槽内平移，进而从轴向、周向两个方向对试剂管进行定位，防止试剂管在容纳腔内随意移动，保证运输安全。

[0050] 以自主培育的花山麻鸡为素材，运用本实用新型对不同发育阶段的鸡不同部位皮肤组织的Wnt3a基因进行定量检测。

[0051] 采集0、1、3、5、7、9周龄各个发育时期的鸡背部和腿部皮肤组织样品置于液氮速冻后转入-80℃冰箱保存；采用总RNA提取试剂裂解法(Trizol)，从采集到的皮肤样本中提取总 RNA，以提取的总RNA为模板，按照RT-PCR试剂盒[宝生物，大连，中国(Takara,Dalian,China)] 说明书反转录合成cDNA第一链。

[0052] 实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增反应：采用DNA双链嵌合绿色荧光染料I(SYBR Green I)染料法，以上述合成的cDNA第一链为模板，设计的Wnt3a正反向引物5和β-actin 基因正反向引物6，在Max3000P荧光定量PCR仪(爱普拜斯)上进行。即鸡各组织样本总 RNA反转录成cDNA第一链后，分别配置Wnt3a和β-actin基因各自进行实时荧光定量PCR (real-time PCR)扩增所需的反应体系，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。

[0053] 荧光定量PCR扩增体系配制如下表1。

[0054] 表1荧光定量PCR扩增体系

[0055]

[0056] 将每个样本的2个基因的扩增体系同时放入荧光定量PCR仪，进行PCR反应，实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增的反应条件设置如下：

[0057] 95℃预变性15min；然后40个循环的95℃变性30s,退火60℃ 30s,72℃ 30s；最后 95℃ 30s,60℃ 30s,95℃ 30s。

[0058] 每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β-actin基因为内参对照，对Wnt3a基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔCt法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct 目的基因-Ct内参基因)，以一个时间点为对照，计算不同发育时期皮肤组织中Wnt3a基因的相对表达量，结果见图6。

[0059] 由图6可以看出，各个发育时期，除了1周龄和7周龄外，Wnt3a表达在背部和腿部皮肤组织均呈显著差异(P<0.05)。Wnt3a的表达高峰是在出雏后0日龄至1周龄，之后表达量显著下调，并持续至9周龄。说明Wnt3a基因在鸡皮肤毛囊早期生长发育中具有重要作用。

[0060] 利用本实用新型Wnt3a基因荧光定量RT-PCR试剂盒进行检测，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、自动化程度高，无污染、实时性好等优点。

[0061] Wnt3a基因在鸡皮肤毛囊生长发育中的作用与其表达量密切相关。实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)相结合使定量极微量的基因表达成为可能，能够广泛用于基因表达、基因功能等方面研究。

[0062] 利用本实用新型通过实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡Wnt3a基因表达的方法，为研究鸡Wnt3a表达调控以及在组织发育中的作用奠定基础，为优质肉鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。