[0001] 本实用新型涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种检测鹤类性别的通用试剂盒。

[0002] 性别是有性繁殖物种的最重要特征，雌雄个体往往在生理、行为、生态等领域具有差别。鸟类的性别鉴定，特别是性别的早期鉴定对鸟类的饲养管理、繁殖与育种、遗传疾病的防治、种群结构和群体遗传分析等方面都有非常重要的意义，在珍稀濒危鸟类的保护和管理中尤为重要。

[0003] 鹤科鸟类均为单态性鸟类，即雌雄同型，它们的性别很难通过外观进行判断区别，这给鹤类的繁殖配对造成了很大的困难。为了更好地在动物园行业以及鹤类保护组织开展鹤类的饲养、繁育、转移、保护和种群可持续发展等工作，必须安全准确地鉴定出它们的性别。目前，鹤类性别鉴定的常规方法是外部形态，行为，细胞生物学，分子生物学等方法。而通过鹤类外部形态，如翻肛等的方式进行性别鉴定，常常使其产生应激，给鹤类的繁育带来负面影响。行为判断的方法常常较主观，且准确性也没有保障。细胞生物学方法又较为繁琐，尤其在开展鹤类繁育、转移和种群可持续工作中并不实用。近年来，随着分子生物学技术的发展，为鹤类的快速性别鉴定奠定了基础。分子生物学技术的兴起，在很大程度上降低了对鸟类带来的不良影响，也降低了错判率，且更为简单，成本低廉。鉴于目前对鹤类性别鉴定的分子生物学技术多样，特通过实践摸索获得鹤类性别鉴定的通用试剂盒，以便高效准确的在同一时间鉴定不同鹤种的性别。

[0004] 鸟类的性别决定系统为ZW型(其中雄性为ZZ，雌性为ZW)。在W染色体上，有一些基因，如CHD基因，ATP5A1基因或假基因EEO.6均非常保守，可以作为性别鉴定的依据。而CHD基因则是判断性别的最佳基因位点，通过采用PCR技术和琼脂糖电泳检测即可进行性别鉴定，十分简便快捷，避免了使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳或限制性内切酶酶切的繁琐工作。双阳性的带型还排除了假阴性的可能性，以此判断鹤类性别结果准确可靠，且价格低廉。实用新型内容

[0005] 本实用新型的目的是提供一种检测鹤类性别的通用试剂盒，该试剂盒能够快速、准确的对鹤类的性别进行鉴定，且价格低廉、便于携带和使用。

[0006] 为了实现上述目的，本实用新型的技术方案是：

[0007] 一种检测鹤类性别的试剂盒，包括盒体、隔热垫、盒体内衬垫、4个试剂瓶、2 个EP管和1个96孔板；所述隔热垫固定在所述盒体内，且位于所述盒体底部；所述盒体内衬垫固定在所述隔热垫上；所述盒体内衬垫上设有分别用于容置所述4个试剂瓶和所述2个EP管的6个孔洞，及放置所述96孔板的1个凹槽；所述4个试剂瓶分别是：装有特异性扩增混合液的第一试剂瓶(瓶体积为3mL)、装有ddH2O的第二试剂瓶(瓶体积为3mL)、装有琼脂糖粉的第三试剂瓶(瓶体积为15mL)和装有电泳缓冲液的第四试剂瓶(瓶体积为15mL)；所述2个EP管为分别装有DNA分子量标准的第一EP管和存放荧光染料的第二EP管(EP管体积为1.5mL)；所述
4个试剂瓶瓶身外侧和所述EP管外壁上均设有防滑贴层；所述盒盖设有透明窗；所述凹槽为长方形；所述盒体一侧壁顶壁设有盒盖，所述盒盖设有透明窗。

[0008] 上述试剂盒中，所述试剂瓶的瓶体均为圆柱形；所述孔洞均为圆柱形。

[0009] 上述试剂盒中，所述透明窗设于所述盒盖中央，为圆形。

[0010] 上述试剂盒中，所述96孔板为可分离式PCR板；

[0011] 上述试剂盒中，所述隔热垫和所述内衬垫的形状和大小均与试剂盒体的底部一致。

[0012] 上述试剂盒中，所述第一试剂瓶的瓶体直径为1.0cm，所述第一试剂瓶所对应的孔洞的直径为1.0cm；所述第二试剂瓶的瓶体直径为1.0cm，所述第二试剂瓶所对应的孔洞的直径为1.0cm；所述第三试剂瓶的瓶体直径为2.0cm，所述第三试剂瓶所对应的孔洞的直径为2.0cm；所述第四试剂瓶的瓶体直径为2.0cm，所述第四试剂瓶所对应的孔洞的直径为2.0cm；所述EP管的体积为1.5ml；所述EP管所对应的孔洞的直径为 1.0cm。

[0013] 上述试剂盒中，所述凹槽的长为12.0cm，宽为2.0cm，深7.0cm。

[0014] 上述试剂盒中，所述第一试剂瓶的瓶体高度为4.2cm，所述第一试剂瓶所对应的孔洞的深度为7.0cm；所述第二试剂瓶的瓶体高度为4.2cm，所述第二试剂瓶所对应的孔洞的深度为7.0cm；所述第三试剂瓶的瓶体高度为5.0cm，所述第三试剂瓶所对应的孔洞的深度为7.0cm；所述第四试剂瓶的瓶体高度为5.0cm，所述第四试剂瓶所对应的孔洞的深度为7.0cm；所述EP管所对应的孔洞的深度为7.0cm。

[0015] 上述试剂盒中，所述第一试剂瓶的瓶口直径为1.3cm；所述第二试剂瓶的瓶口直径为1.3cm；所述第三试剂瓶的瓶口直径为2.3cm；所述第四试剂瓶的瓶口直径为 2.3cm。

[0016] 上述试剂盒中，所述第一试剂瓶、所述第二试剂瓶、所述第三试剂瓶、所述第四试剂瓶瓶身上分别附着有银灰色涂层；或所述第一试剂瓶、所述第二试剂瓶、所述第三试剂瓶、所述第四试剂瓶的瓶盖上分别附着有白色涂层；所述EP管的的管身上附着有银灰色涂层。

[0017] 上述试剂盒中，所述孔洞呈两列纵向设置于所述盒体内衬垫上；左列孔洞由远及近分别设有所述第一试剂瓶所对应的孔洞和所述第二试剂瓶所对应的孔洞；右列孔洞由远及近分别设有所述第三试剂瓶所对应的孔洞、所述第四试剂瓶所对应的孔洞和所述EP管所对应的孔洞。

[0018] 上述试剂盒中，在与所述盒盖相邻的所述盒体两侧壁顶部分别设有内盖。

[0019] 上述试剂盒中，所述第一试剂瓶所对应的孔洞与所述第二试剂瓶所对应的孔洞的圆心在一条直线上，且与左右侧壁平行；所述第三试剂瓶所对应的孔洞、所述第四试剂瓶所对应的孔洞、所述第一EP管所对应的孔洞和所述第二EP管所对应的孔洞的圆心在一条直线上，且与左右侧壁平行。

[0020] 上述试剂盒中，所述盒体形状为正方体。

[0021] 本实用新型鹤类性别快速鉴定通用试剂盒的使用方法：以待测鹤类的总DNA为模板，以本实用新型中的特异性扩增混合物对目的片段进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。当扩增产物只出现一条特异性带时判定为雄性(ZZ型)，当扩增时出现两条特异性扩增带时判定为雌性(ZW型)。

[0022] 取10ml 50×TAE，加超纯水1L配制成1×TAE电泳液。以0.5g琼脂糖粉，加入 50ml1×TAE放入微波炉高温加热3min，加入荧光染料(Goldview)混匀，配制1％琼脂糖胶。将1％琼脂糖胶置于电泳仪中，加入1×TAE电泳液，用移液枪取8μl反应物产物加至凝胶孔中，在其中一孔内加入DNA marker作为片段长度参考。电泳仪电压设置为8V/cm，电泳30min。根据PCR扩增产物电泳图进行性别鉴定。

[0023] 本实用新型可用于存放检测鹤类性别的PCR试剂盒和电泳试剂，其能够隔绝外部温度，使试剂的活性在使用过程中得到较好的保护，且结构简单、成本低，便于使用和推广。

[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0026] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0027] 实施例1、快速检测鹤类性别的试剂盒

[0028] 如附图1所示，一种快速检测鹤类性别的试剂盒，包括盒体1、隔热垫2、盒体内衬垫3、4个试剂瓶4-7、2个EP管8-9和1个96孔孔板10；盒体形状为正方体；盒体一侧壁顶壁设有盒盖11，盒盖11中央设有圆形透明窗12；与盒盖相邻的盒体左右侧壁顶部分别设有内盖13。
隔热垫固定在盒体内，且位于盒体底部；盒体内衬垫固定在隔热垫上；所述隔热垫和所述内衬垫的形状和大小均与试剂盒体的底部一致；盒体内衬垫上设有分别用于容置4个试剂瓶和2个EP管的6个孔洞，及放置96孔板的1 个凹槽；4个试剂瓶分别是：装有特异性扩增混合液的第一试剂瓶4(瓶体积为3mL)、装有ddH2O的第二试剂瓶5(瓶体积为3mL)、装有琼脂糖粉的第三试剂瓶6(瓶体积为15mL)和装有电泳缓冲液的第四试剂瓶7(瓶体积为15mL)；2个EP管分别为为装有DNA分子量标准的第一EP管8和存放荧光染料的第二EP管9(EP管体积为 
1.5mL)；孔洞呈两列纵向设置于所述盒体内衬垫上；左列孔洞由远及近分别设有第一试剂瓶4所对应的孔洞和第二试剂瓶5所对应的孔洞；右列孔洞由远及近分别设有第三试剂瓶6所对应的孔洞、第四试剂瓶7所对应的孔洞、第一EP管8和第二EP管9 所对应的孔洞。所述第一试剂瓶4所对应的孔洞与所述第二试剂瓶5所对应的孔洞的圆心在一条直线上，且与左右侧壁平行；所述第三试剂瓶6所对应的孔洞、所述第四试剂瓶7所对应的孔洞、所述第一EP管
8所对应的孔洞与所述第二EP管9所对应的孔洞的圆心在一条直线上，且与左右侧壁平行。
试剂瓶的瓶体均为圆柱形；孔洞均为圆柱形。所述凹槽为长方形，长为12.0cm，宽为2.0cm，深7.0cm。所述96孔板10 为可分离式PCR板。试剂瓶瓶身外侧和EP管外管壁上均设有防滑贴层14。

[0029] 隔热垫2能够隔绝底部的热量，防止外界温度对试剂内部的影响。

[0030] 圆形透明窗12可用于查看内部试管瓶和EP管的情况。

[0031] 所述防滑贴层14与所述试管瓶平身外侧和EP管外壁活动链接，可用于防止取用使打滑。

[0032] 第一试剂瓶4的瓶体直径为1.0cm，第一试剂瓶4所对应的孔洞的直径为1.0cm；第二试剂瓶5的瓶体直径为1.0cm，第二试剂瓶5所对应的孔洞的直径为1.0cm；第三试剂瓶6的瓶体直径为2.0cm，第三试剂瓶6所对应的孔洞的直径为2.0cm；第四试剂瓶7的瓶体直径为2.0cm，第四试剂瓶7所对应的孔洞的直径为2.0cm；EP管8和9 的体积分别为1.5ml；EP管8和
9所分别对应的孔洞的直径为1.0cm。

[0033] 第一试剂瓶4的瓶体高度为4.2cm，第一试剂瓶4所对应的孔洞的深度为7.0cm；第二试剂瓶5的瓶体高度为4.2cm，第二试剂瓶5所对应的孔洞的深度为7.0cm；第三试剂瓶6的瓶体高度为5.0cm，第三试剂瓶6所对应的孔洞的深度为7.0cm；第四试剂瓶7的瓶体高度为5.0cm，第四试剂瓶7所对应的孔洞的深度为7.0m；EP管8和9所分别对应的孔洞的深度为
7.0cm。

[0034] 第一试剂瓶4的瓶口直径为1.3cm；第二试剂瓶5的瓶口直径为1.3cm；第三试剂瓶6的瓶口直径为2.3cm；第四试剂瓶7的瓶口直径为2.3cm。

[0035] 第一试剂瓶4、所述第二试剂瓶5、所述第三试剂瓶6、所述第四试剂瓶7的瓶身上分别附着有银灰色涂层；第一试剂瓶4、所述第二试剂瓶5、所述第三试剂瓶6、所述第四试剂瓶7的瓶盖上分别附着有白色涂层；EP管8和EP管9的管身上分别附着有银灰色涂层。

[0036] 实施例2、检测鹤类性别的试剂盒在检测鹤类性别中的应用

[0037] 运用实例1中的试剂盒对已知性别的3只蓝鹤、2只赤颈鹤、2只白枕鹤、1只肉垂鹤、3只白头鹤、2只白鹤、2只灰鹤、4只蓑羽鹤、1只灰冠鹤、1只黑冠鹤、1只丹顶鹤、1只黑颈鹤进行了性别鉴定，

[0038] 1.样品

[0039] 采集翅下次级飞羽，提取翅下次级飞羽髓鞘中的DNA，DNA浓度应在30-50ng/μl。

[0040] 2.PCR扩增反应及结果

[0041] 1)PCR扩增反应体系准备

[0042] 总体积为25μl，其中：2μL模板DNA，14.5μL扩增缓冲液，8.5μLddH2O。

[0043] 2)PCR扩增反应程序设置

[0044] 为94℃预变性3min；94℃30S，52℃50S，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。反应完毕后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

[0045] 2.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定

[0046] 将1％琼脂糖凝胶置于1×TEB电泳液中(取50×TAE 10ml，加入1L超纯水配置成1×TEB)。以0.5g琼脂糖，加入50ml的1×TAE放入微波炉高温加热3min,加入荧光染料混匀，配制1％琼脂糖胶。将1％琼脂糖胶置于电泳仪中，加入1×TAE电泳液，用移液枪取8μl扩增产物加至凝胶孔中，在其中一孔内加入DNA分子量标准作为片段长度参考。取8μl扩增产物点样于凝胶孔中，室温下电泳30min，电泳仪电压设置为 8V/cm。在对应DNA分子量标准360bp附近，出现PCR产物的W带，在对应DNA 分子量标准500bp附近出现Z带。如出现Z带，则为雄性；如Z带和W带同时出现，则为雌性。

[0047] 根据电泳结果可知：蓝鹤1-2号为雌性，3号为雄性；赤颈鹤4号为雄性，5号为雌性；白枕鹤6-7号为雄性；肉垂鹤8号为雄性；白头鹤9-10号为雄性，11号为雌性；白鹤12号为雌性，13号为雄性；灰鹤14号为雄性，15号为雌性；蓑羽鹤16-18号为雌性，19号为雄性；灰冠鹤
20号为雌性；黑冠鹤21号为雌性；丹顶鹤22号为雄性；黑颈鹤23号为雌性。通过分子鉴定的性别结果与通过解剖观察性腺的结果没有差异，准确率100％。

[0048] 综上所述，本实用新型可用于存放检测鹤类性别的PCR试剂盒和电泳试剂，其能够隔绝外部温度，使试剂的活性在使用过程中得到较好的保护，且结构简单、成本低，便于使用和推广。