[0001] 本实用新型涉及一种快速鉴定人类Y染色体STR分型的试剂盒，属于试剂盒领域。

[0002] 人类Y染色体的遗传多态性具有如下研究优势：在遗传过程中不与另外的染色体发生重组，突变是多样性改变的唯一因素，使得按年代先后发生的各种稳定的单倍型得以保存和进化，从而能够构建出很清楚的Y染色体基因进化谱系树；Y染色体的序列结构特征能稳定地由父亲传给儿子并为男性所特有，具有父系遗传特点；非重组区域具有较低的群体内多态性和较高的群体间变异，易产生人群特异性的单倍型，从而使得其分布方式具有极高的地理特异性；Y染色体非重组区域发生回复、平行突变的概率非常低，增加了Y染色体基因谱系树的可靠性；非重组区域突变率相对稳定，能够很好的区分群体间亲缘关系，STR的突变率高，能够很好区分近代人群个体之间的亲缘关系。

[0003] 早期的Y-STR复合扩增体系中仅包含有12个左右的Y-STR基因座，而随着DNA作为鉴定手段的应用愈加广泛、数据比对的增加和Y-STR父系遗传的特性不断研究，这就需要更多的基因座来提供更多的信息量以满足各方面的需求，比如在亲子鉴定、失踪人口比对时，为了避免误判的发生，往往需要辅助多种试剂盒进行联合使用，以达到检测的准确度要求。另外，随着我国DNA数据库建设规模将不断扩大，数据比对的作用也愈发的重要，这就需要STR试剂盒在基因座位上具有较高的兼容性。
实用新型内容

[0004] 本实用新型的目的是提供一种能够缩短检测时间、提高检测效率的快速鉴定人类Y染色体STR分型的试剂盒。

[0005] 为解决上述技术问题，本实用新型所采用的技术方案如下：

[0006] 一种快速鉴定人类Y染色体STR分型的试剂盒，包括盒体以及与盒体转动连接的翻盖式盒盖，盒体内设有一纸托，纸托将盒体内分为上下两层；纸托上设有试剂管区和离心管区；试剂管区上设有七个以上的试管孔，离心管区上设有六个以上离心管孔，试剂管区的试管孔内设有1管以上的2.5×PCR Mix试管、1管以上的Y27plex primers试管、1管以上的Taq DNA聚合酶试管、2管以上的DNA标准品试管和2管以上的去离子超纯水试管，所有的试管上均设有试管盖。

[0007] 上述试管孔和离心管孔不交叉设置；每个试管孔对应一个试管。2.5×PCR Mix试管指装有2.5×PCR扩增混合液的试管，Y27plex primers试管指装有27plex引物的试管；Taq DNA聚合酶试管指装有Taq DNA聚合酶的试管；DNA标准品试管指装有DNA标准品的试管；去离子超纯水试管指装有去离子超纯水的试管。

[0008] 为了节约材料，缩小体积，同时满足日常需求，2.5×PCR Mix试管和去离子超纯水试管均为1.5mL试管；Y27plex primers试管、Taq DNA聚合酶试管和DNA标准品试管均为500μL试管。

[0009] 为了节约材料，缩小体积，同时方便使用，试剂盒为立方体结构，长为6±1cm，宽为6±1cm，高为4±1cm。

[0010] 为了简化结构，节约成本，同时保证装置的使用稳定性，纸托包括支撑面和沿支撑面底部四周设置的支撑脚，支撑脚设置在合体内底面上；试剂管区和离心管区设在支撑面上。

[0011] 本申请上下、顶部、底部等范围词，均指装置正常使用的相对位置。

[0012] 作为本申请的另一种改进，纸托包括上支撑面、下支撑面和支撑圏，支撑圈将上支撑面和下支撑面连为一体结构，下支撑面为海绵层，下支撑面与合体内底面接触，试剂管区和离心管区设在上支撑面上。这样能对各试管和离心管起到更好的防护效果。

[0013] 为了方便使用，同时更好的保护试剂，纸托上设有8-10个试管孔，试管孔的内表面设有第一弹性层，至少三个试管孔的孔径为11-12mm，其余试管孔的孔径为9-10mm。多余的试管孔用来备用。

[0014] 为了方便使用，同时更好的保护试剂，纸托上设有6-8个离心管孔，离心管孔的内表面设有第二弹性层，离心管孔的孔径为8-12mm。离心管孔的设置是为了方便试剂盒使用过程中离心管的放置。

[0015] 为了方便区分，便于操作，优选地，2.5×PCR Mix试管的试管盖顶部设有蓝色盖帽，Y27plex primers试管的试管盖顶部设有绿色盖帽，DNA标准品试管的试管盖顶部设有白色盖帽，Taq DNA聚合酶试管的试管盖顶部设有黄色盖帽，去离子超纯水试管的试管盖顶部设有无色盖帽。

[0016] Y27plex primers试管内含有不同荧光标记的特异性扩增引物。

[0017] 进一步优选，试剂管区的试管孔内设有1管2.5×PCR Mix试管、1管Y27plex primers试管、1管Taq DNA聚合酶试管、2管DNA标准品试管和2管去离子超纯水试管。

[0018] 本实用新型未提及的技术均参照现有技术。

[0019] 本实用新型快速鉴定人类Y染色体STR分型的试剂盒，具有检测范围广、分型准确性高、灵敏度高、稳定性强等特点；此外，试剂盒包括27个位点，一次性扩增27个人类Y染色体STR基因座，其中，包含7个快速突变位点，突变率高、多态性好，从而具有更高的个体识别能力和分辨率，在排查男性家系时，能够进一步缩小范围；既能够满足检测灵敏度的要求、又能够节约大量资本，另外还具有操作简单等特点，不仅能带来可观经济效益，还能实现快速检测。

[0029] 为了更好地理解本实用新型，下面结合实施例进一步阐明本实用新型的内容，但本实用新型的内容不仅仅局限于下面的实施例。

[0030] 实施例1

[0031] 如图所示，一种快速鉴定人类Y染色体STR分型的试剂盒，长为6cm，宽为6cm，高为4cm，试剂盒包括：盒体以及与盒体转动连接的翻盖式盒盖，盒体内设有一纸托，纸托将盒体内分为上下两层；纸托包括支撑面和沿支撑面底部四周设置的支撑脚，支撑脚设置在合体内底面上；支撑面上设有试剂管区和离心管区；试剂管区上设有十个试管孔，试管孔的内表面设有第一弹性层，有五个试管孔的孔径为11.5mm，其余试管孔的孔径为9.5mm，离心管区上设有八个离心管孔，离心管孔的内表面设有第二弹性层，离心管孔的孔径为9mm，十个试管孔中的其中七个试管孔内分别设有1管2.5×PCR Mix试管、1管Y27plex primers试管、1管Taq DNA聚合酶试管、2管DNA标准品试管和2管去离子超纯水试管，其余试管孔作为备用，便于试剂盒后期升级，满足后期增加试剂用孔需要；2.5×PCR Mix试管和去离子超纯水试管均为1.5mL试管；Y27plex primers试管、Taq DNA聚合酶试管和DNA标准品试管均为500μL试管。Y27plex primers内含有不同荧光标记的特异性扩增引物。管盖用不同颜色区分不同试剂，便于使用者操作，2.5×PCR Mix试管的试管盖顶部设有蓝色盖帽，Y27plex primers试管的试管盖顶部设有绿色盖帽，DNA标准品试管的试管盖顶部设有白色盖帽，Taq DNA聚合酶试管的试管盖顶部设有黄色盖帽，去离子超纯水试管的试管盖顶部设有无色盖帽。

[0032] 实施例2

[0033] 与实施例基本相同，所不同的是：纸托包括上支撑面、下支撑面和支撑圏，支撑圈将上支撑面和下支撑面连为一体结构，下支撑面为海绵层，下支撑面与合体内底面接触，试剂管区和离心管区设在上支撑面上。

[0034] 本申请与目前市场上同类型的Y染色体STR试剂盒(见表1)相比不仅兼容了使用率较高的20个常规的低突变率基因座(突变率低于1％)：DYS393，DYS19，DYS392，Y_GATA_H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533，DYS456，DYS389I/II，DYS390，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437和DYS385a/b；还包含7个快速突变基因座(突变率高于1％)：DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a/b，DYS449和DYS518，从而提高了近亲男性个体区分准确度。

[0035] 表1.与市面上主流商业化常Y-STR荧光检测试剂盒基因座对比

[0036]

[0037]

[0038] 注：+表示被包括的基因座，-表示不包括的基因座

[0039] 表2.本实用新型引物信息

[0040]

[0041]

[0042]

[0043] 注：加粗字体的为5′端荧光标记的碱基，下划线的为中间荧光标记的碱基，对应的荧光素为对应相同的加粗或下划线标记

[0044] 应用例1.Y-STR复合扩增试剂的制备

[0045] 1.Y-STR复合扩增检测系统位点的排布

[0046] 本实用新型的Y-STR试剂盒包含目前常用的20个低突变率基因座：DYS393，DYS19，DYS392，Y_GATA_H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533DYS456，DYS389I/II，DYS390，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437和DYS385a/b；以及7个快速突变型位点：DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1a/b，DYS449和DYS518。

[0047] 上述STR位点的排布方式如图3所示。

[0048] 2.Y-STR复合扩增体系专用引物

[0049] 根据上述位点设计复合扩增引物、引物序列、引物浓度及荧光素标记方式如表2所示。

[0050] 3.Y-STR荧光复合扩增验证系统的制备

[0051] 试剂盒包括以下成份：

[0052]

[0053] 5×Primers为表2所示的48条引物按照表2所示的浓度进行混匀。

[0054] 每25μL的PCR扩增体系如下：

[0055]

[0056] 下表为2.5×PCR Mix的组分

[0057]

[0058]

[0059] PCR扩增体系即为配制好进行PCR反应的各组分混合物。

[0060] 因此，DNA检测试剂由具有表2所示浓度的复合扩增引物、浓度为5mM的MgCl2、终浓度为125mM的Tris-HCl、终浓度为125mM的KCl、终浓度为0.5mM的dNTPs、1.5mg/mL的BSA、5U/μL的DNA聚合酶和去离子超纯水组成。

[0061] Marker Orange-500按专利201610988458.1方法制备。本实用新型还提供了用于分析的等位基因分型标准物，各个基因座引物分别扩增对应等位基因，扩增产物组合而成。图4为Allellic ladder电泳图谱。DNA标准品DNA 9947A购自美国promega公司。热启动酶购自大连宝生物。

[0062] 应用例2.Y-STR复合扩增验证试剂的应用

[0063] 1.样本扩增

[0064] 将24μL由应用例1制备的DNA检验试剂加入1μL的0.5ng/μL男性DNA标准品M4615，进行PCR扩增。

[0065] PCR扩增程序为：95℃3分钟；94℃5秒钟、60℃1分钟，30个循环；60℃终延伸10分钟；4-16℃保持。

[0066] 2.PCR产物的检测

[0067] 扩增反应结束后，取出反应管，用ABI3100遗传分析仪进行电泳和检测。

[0068] 1)取(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液混匀后分装，每管10μL。

[0069] 2)再分别加入1μL扩增产物或等位基因阶梯(ladder)，短暂离心将液体收集到离心管管子底部样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使DNA完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中。

[0070] 3)设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测大约40分钟后，电泳结束。随后，用Gene Mapper软件进行数据分析，其检测结果如下图5所示，上述男性DNA标准品得到完整的STR分型，并且峰型尖锐清晰，平衡性好，无Pull-up峰，无stutter带，无非特异性人工产物出现。

[0071] 应用例3.Y-STR复合扩增验证试剂对男女混合斑中男性个体的识别

[0072] 将24μL由应用例1制备的DNA检验试剂加入1μL的男女性DNA混合物，其中，男性DNA样本MM46150.1ng，女性DNA样本9947A 2ng。按照应用例2的加样体积及扩增程序进行扩增、检测。其检测结果如图6所示，上述混合样本能够检测到完整的男性DNA样本的STR分型，且对女性样本无扩增。

[0073] 应用例4.本实用新型与常规标记方法扩增体系的灵敏度比较

[0074] 对本实用新型扩增男性DNA模版的灵敏度，与常规单荧光标记的引物进行对比。分别配制本实用新型的双荧光标记和常规单荧光标记的两组引物池，引物浓度按各自的最优条件组配，具体见下表。

[0075]

[0076]

[0077] 单荧光标记和双荧光标记的引物分别进行灵敏度的测试，加入不同浓度的男性标准品DNAM4615(500pg、250pg、125pg、62.5pg和31.25pg)，扩增程序以各自最优程序进行，如下：

[0078] 双荧光标记引物组：95℃3分钟；94℃5秒钟，60℃1分钟运行30个循环；60度10分钟，4-16℃持续保温，直至取出样品。

[0079] 单荧光标记引物组：95℃3分钟；94℃10秒钟，60℃1分钟，72度1min，运行30个循环；60度30分钟，4-16℃持续保温，直至取出样品。

[0080] 除了扩增程序外，其他按照应用例2的方法进行操作。检测结果：双荧光标记的灵敏度可达31.25pg，且色间峰高较均衡，如下图7所示。而常规单荧光标记灵敏度只能达到125pg，如下图8所示。常规单荧光标记的引物扩增的色间均衡性和整体峰高不如双荧光标记的引物。采用双荧光标记的引物，由于信号的提高，引物用量较常规单荧光标记引物用量要少。尤其对于TAMRA和ROX这两种波长较大的荧光标记，常规单标记引物用量是双标记引物用量的数倍，然而扩增信号强度及均衡性仍不及双标记引物。

[0081] 因此上述试剂盒具有检测范围广、分型准确性高，灵敏度高，稳定性强等特点；上述试剂盒包括27个位点，一次性扩增27个人类Y染色体STR基因座，涵盖当前主流试剂盒的全部STR基因座，提供了最大的兼容性和更多的信息量，其中包含7个快速突变位点，突变率高，多态性好，从而具有更高的个体识别能力和分辨率，在排查男性家系时，能够进一步缩小范围；既能够满足检测灵敏度的要求，又能够节约大量资本，另外还具有操作简单等特点，不仅能带来可观经济效益，还能实现快速检测。