技术领域
[0001] 本实用新型属于生物技术领域，尤其涉及鸡IRS1基因表达荧光定量RT-PCR试剂盒，主要用于鸡IRS1基因在肌肉和肝脏代谢、生长、分化中的作用机理研究。
相关背景技术
[0002] 胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)是Insulin/IGF1信号通路的关键节点的重要代表。IRS1能够将IGF1受体的信号传递给细胞内PI3K/Akt和MAPK/Erk信号通路，在骨骼肌生长发育，葡萄糖元摄取和合成方面具有重要的作用。在肝脏中，IRS1介导胰岛素非依赖性调节糖脂代谢，对饲喂后期的信号传导非常重要。肉鸡是动物蛋白的重要来源之一，胸肌和腿肌骨骼肌的生长发育直接影响鸡上市后产肉量的高低。因此，研究鸡肝脏和肌肉中 IRS1的作用机理对于优质鸡育种具有重要作用。
[0003] 实时荧光定量PCR技术是生命科学领域的一项重要技术，是快速检测基因表达水平的首选方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃，使定量极微量的基因表达成为可能，能够广泛用于基因表达、基因功能等方面。实用新型内容
[0004] 本实用新型的目的是提供一种鸡IRS1基因表达荧光定量RT-PCR试剂盒，本实用新型试剂盒准确性高、快速、价格低廉，通过建立实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡IRS1基因表达，为研究鸡IRS1表达调控以及肌肉生长发育调控奠定基础，为优质鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。
[0005] 本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，一种鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括盒体，盒体内设有DNA双链嵌合绿色染料(SYBR Green Master)启动荧光PCR混合物、鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因GAPDH 表达的特异性正反向引物、定量PCR参比染料(ROX)、灭菌无核酸酶水(DEPC)、稀释缓冲液(Dilution buffer)。
[0006] 其中，鸡IRS1基因正反向引物序列为：
[0007] F:5，—CTACCGCCTGTGCCTGACTAAC—3，
[0008] R:5，—CGTCCCACCTCGATGAAGAAG—3；
[0009] 以及鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物序列为:
[0010] F:5，—CGATCTGAACTACATGGTTTAC—3，
[0011] R:5,—TCTGCCCATTTGATGTTGC—3。
[0012] 优选的，所述盒体内设有缓冲带，缓冲带内侧壁上设有六个弹性口袋，弹性口袋沿缓冲带宽度方向设置，弹性口袋中放置试剂。
[0013] 优选的，所述缓冲带为可折叠结构，缓冲带可折叠成口字型结构，缓冲带可展开成一字型结构。
[0014] 优选的，所述六个弹性口袋中，三个弹性口袋组成一组，六个弹性口袋分成两组；缓冲带折叠时，两组弹性口袋相对设置。
[0015] 上述鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒的使用方法如下：
[0016] (1)组织RNA的抽提与纯化：从鸡肌肉和肝脏组织中提取总RNA并纯化，用稀释缓冲液(Dilution buffer)将RNA稀释为同一浓度；
[0017] (2)cDNA第一链的合成：以步骤(1)中稀释后的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；
[0018] (3)实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增反应：采用DNA双链嵌合绿色荧光染料法(SYBR Green)，以上述步骤(1)设计的IRS1正反向引物和GAPDH基因正反向引物和步骤(2)合成的cDNA第一链为模板，在荧光定量PCR仪上进行；本实用新型所述步骤(3) 中实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增的反应条件设置如下：95℃预变性15min；然后40个循环的95℃变性10s,退火60℃ 30s。
[0019] 鸡组织样本经反转录成cDNA第一链后，对IRS1和GAPDH基因基因按照设定好的条件同时进行实时荧光定量PCR(real time PCR)反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以GAPDH基因为内参照，对IRS1基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔCT法对数据进行处理，计算IRS1基因相对表达量。
[0020] 与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：
[0021] 第一，本实用新型利用IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒进行检测，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、污染少，操作方便等优点。
[0022] 第二，本实用新型将试剂盒内的试剂直接设计在缓冲带内侧，通过弹性口袋的弹性力，将试剂压紧在弹性口袋内，防止试剂瓶在盒体内发生晃动。缓冲带具有两个作用，一个是安置试剂瓶，另一个是作为盒体的缓冲材料，防止运输过程中发生磕碰。弹性带的作用也有二，一是存放试剂瓶，二是当缓冲带折叠时，弹性口袋亦可作为试剂瓶之间的换成材料，防止试剂瓶之间发生摩擦。
具体实施方式
[0031] 结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。
[0032] 实施例1鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒
[0033] 如图1-3所示，一种鸡IRS1基因荧光定量RT-PCR试剂盒，包括盒体1，盒体1内设有缓冲带8，缓冲带8内侧壁上设有六个弹性口袋9，弹性口袋9沿缓冲带8宽度方向设置。
[0034] 六个弹性口袋9中分别放置DNA双链嵌合绿色染料(SYBR Green Master)热启动荧光 PCR混合物2、鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物3、定量PCR参比染料(ROX)4、鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物5、灭菌无核酸酶水(DEPC)6、稀释缓冲液 (Dilution buffer)7。
[0035] 其中，鸡IRS1基因表达的特异性正反向引物3序列为：
[0036] F:5，—CTACCGCCTGTGCCTGACTAAC—3，
[0037] R:5，—CGTCCCACCTCGATGAAGAAG—3；
[0038] 鸡内参基因GAPDH表达的特异性正反向引物5序列为:
[0039] F:5，—CGATCTGAACTACATGGTTTAC—3，
[0040] R:5,—TCTGCCCATTTGATGTTGC—3。
[0041] 缓冲带8为可折叠结构，缓冲带8可折叠成口字型结构，缓冲带8可展开成一字型结构。缓冲带具有两个作用，一个是安置试剂瓶，另一个是作为盒体的缓冲材料，防止运输过程中发生磕碰。缓冲带为可折叠结构，可节省一半的空间。
[0042] 六个弹性口袋9中，三个弹性口袋9组成一组，六个弹性口袋9分成两组；缓冲带8折叠时，两组弹性口袋9相对设置。弹性口袋的作用也有二，一是存放试剂瓶，二是当缓冲带折叠时，弹性口袋亦可作为试剂瓶之间的换成材料，防止试剂瓶之间发生摩擦。
[0043] 本实用新型将试剂盒内的试剂直接设计在缓冲带内侧，通过弹性口袋的弹性力，将试剂压紧在弹性口袋内，防止试剂瓶在盒体内发生晃动。
[0044] 实施例2：IRS1基因在鸡不同发育阶段肌肉和肝脏组织中的差异表达量分析[0045] 以自主培育的花山麻鸡和地方品种清远麻鸡为素材，运用本实用新型对不同发育阶段的鸡不同部位皮肤组织的IRS1基因进行定量检测。
[0046] 采集9、12、16、21胚龄和出雏后7日龄各个发育时期的鸡肝脏和腿部肌肉组织样品置于液氮速冻后转入-80℃冰箱保存；采用总RNA提取试剂裂解法(Trizol)，从采集到的肝脏和肌肉样本中提取总RNA。将各个样品的总RNA浓度用试剂盒中的稀释缓冲液(Dilution buffer)稀释，所有样品最终稀释的浓度为500ng/ul。以稀释后的总RNA为模板，按照RT-PCR 试剂盒[宝生物，大连，中国(Takara,Dalian,China)]说明书反转录合成cDNA第一链。
[0047] 实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增反应：采用DNA双链嵌合绿色荧光染料I(SYBR Green I)染料法，以上述稀释后的cDNA第一链为模板，设计的IRS1正反向引物和GAPDH 基因正反向引物，在Max3000P荧光定量PCR仪(爱普拜斯)上进行。即各组织样本总RNA 反转录成cDNA第一链后，分别配置IRS1和GAPDH基因各自进行实时荧光定量PCR (real-time PCR)扩增所需的反应体系，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。
[0048] 荧光定量PCR扩增体系配制如下
[0049]
[0050]
[0051] 将每个样本的2个基因的扩增体系同时放入荧光定量PCR仪，进行PCR反应，实时荧光定量PCR(real time PCR)扩增的反应条件设置如下：
[0052] 95℃预变性15min；然后40个循环的95℃变性10s,退火60℃ 30s。
[0053] 每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以GAPDH基因为内参对照，对IRS1基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔCt法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct 目的基因-Ct内参基因)，以一个时间点为对照，计算不同发育时期肝脏和肌肉组织中IRS1 基因的相对表达量。结果见图4-5。
[0054] 由图4可以看出，各个发育时期，胚胎期9胚龄至16胚龄，肝脏IRS1的表达量在各个时间点之间无显著差异。21胚龄和7日龄肝脏中IRS1表达显著高于胚胎期9胚龄至16胚龄。品种间比较，12胚龄时，肝脏IRS1的表达量在品种间差异显著(P<0.05)。
[0055] 由图5可以看出，鸡肌肉中IRS1的表达量是从高到低的过程。9胚龄时，两个品种的肌肉组织中IRS1基因的表达量都较高，出雏后7日龄时，IRS1基因表达量显著下调。品种间比较，肌肉中除21胚龄外，其他各个时间点，品种间IRS1的表达量都呈显著差异(P<0.05)。以上结果提示，IRS1可能在肌肉生长发育中具有重要的作用。
[0056] 本实用新型试剂盒利用实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡IRS1基因表达，为研究鸡IRS1 表达调控以及在组织发育中的作用奠定基础，为优质肉鸡育种提供理论依据，具有潜在的应用价值。
