[0001] 本实用新型属于生物技术领域，尤其涉及鸡RNA m6A甲基转移酶3(METTL3)和甲基转移酶14(METTL14)基因表达检测试剂盒，主要用于鸡生长发育和疾病等方面的研究。

[0002] RNA m6A修饰是指RNA腺嘌呤(A)的N6位引入甲基的过程。研究表明，RNA m6A 修饰是高等真核生物体内最常见的转录后修饰，介导了超过80％的RNA碱基甲基化，通过调控6
RNA稳定、定位、运输、剪接和翻译来发挥重要的生物学功能。甲基转移酶是RNA mA 生物学
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过程的一种关键调控蛋白，催化RNA上的腺嘌呤发生m A。甲基转移酶以复合物存在形式发
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挥生物学作用，包括mA‑METTL复合体和mA‑METTL关联复合体。mA‑METTL 复合体包括甲基转移酶3(METTL3)与甲基转移酶14(METTL14)，它们可以形成稳定的异二聚体，前者作为催
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化亚基是第一个被发现的甲基转移酶，后者可以促进与RNA的结合，它们是RNA m A修饰所必需的。

[0003] 近年来，越来越多的研究表明，RNA m6A修饰在基因表达调控、动物发育和人类疾6
病中起着重要作用，而目前在鸡上有关RNA mA修饰研究的报道还比较少。因此开发参与鸡
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RNA mA修饰生物学过程的重要基因定量检测试剂盒，用于鸡生长发育和疾病等方面的研究，对家禽生产等实际应用方面将提供帮助。
实用新型内容

[0004] 本实用新型的目的是提供一种RNA m6A甲基转移酶定量检测试剂盒，本实用新型试剂盒准确性高、快速、价格低廉，通过实时荧光定量RT‑PCR技术检测鸡METTL3基因和METTL14 基因在组织和细胞中的表达量。

[0005] 本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，RNA m6A甲基转移酶定量检测试剂盒，包括盒体和盖体，其特征是，所述盒体内设有SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物、鸡METTL3基因正反向引物、鸡METTL14基因特异性正反向引物、鸡内参基因GAPDH正反向引物、ROX染料、灭菌DEPC水。

[0006] 优选的，所述鸡METTL3基因正反向引物序列为：

[0007] F:5’‑GCCATCGATACGCCCGAAAC‑3’；

[0008] R:5’‑TAGGTGACGATGGTGGGACC‑3’。

[0009] 优选的，所述鸡METTL14基因正反向引物序列为：

[0010] F:5’‑CTGGATCTTGGCCGAGTGTG‑3’；

[0011] R:5’‑AGGCAGTGCTCCTTGGTTCT‑3’。

[0012] 优选的，所述鸡内参基因GAPDH正反向引物序列为：

[0013] F:5’‑CGATCTGAACTACATGGTTTAC‑3’；

[0014] R:5’‑TCTGCCCATTTGATGTTGC‑3’。

[0015] 优选的，所述盒体与盖体之间通过活动件相连接，

[0016] 盖体侧壁上设有锁紧孔；盒体侧壁上设有容纳腔，容纳腔内设置弹性件，弹性件自由端设置安装板，安装板上设有锁紧块，锁紧块伸入锁紧孔内并在弹性件的作用下，实现盖体与盒体的锁紧。

[0017] 优选的，所述安装板下部设有按压部；按压部位于锁紧的盒体侧壁下方。

[0018] 优选的，所述按压部、盒体侧壁相对端面上对应设有相配合的导向块、导向槽。

[0019] 优选的，所述盒体内设有衬垫，衬垫上设有试剂容纳腔。

[0020] 与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：

[0021] 第一，通过本实用新型试剂盒可得到METTL3基因和METTL14基因在胸大肌和前背阔肌中的相对表达量：以慢肌纤维为主的前背阔肌中METTL3基因和METTL14基因的表达量均显著高于以快白肌纤维为主的胸大肌(P<0.05)。提示，METTL3基因和METTL14基因的表达与肌纤维类型密切相关。

[0022] 第二，本实用新型对盒体和盖体的锁紧结构进行改进，通过可移动的锁定块与锁定孔的配合，实现盖体的锁紧与开启；锁定块在弹性件的作用下，向前顶出，伸入锁定孔内，实现锁紧；按压弹性件内缩，带动锁紧块后移，即可开启盖体。

[0023] 第三，本实用新型在安装板上设置按压部，方便对弹性件施力，且按压部隐藏在盒体侧壁下方，外端面不突出于盒体侧壁外侧面。

[0024] 第四，本实用新型在按压部、盒体侧壁相对端面上对应设有相配合的导向块、导向槽，保证盖体运动的一致性。

[0031] 如图1‑5所示，一种RNA m6A甲基转移酶定量检测试剂盒，包括盒体1、盖体2，盒体 1与盖体2之间通过活动件19相连接。活动件19可以为铰连，也可以为弹性塑料件。

[0032] 盒体1内设有衬垫3，衬垫3上设有若干个试剂容纳腔4，试剂容纳腔4中分别设置SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物5、鸡METTL3基因特异性正反向引物6、鸡METTL14 基因特异性正反向引物7、鸡内参基因GAPDH特异性正反向引物8、ROX染料9、灭菌DEPC 水10。

[0033] 其中，鸡METTL3基因正反向引物6序列为：

[0034] F:5’‑GCCATCGATACGCCCGAAAC‑3’，

[0035] R:5’‑TAGGTGACGATGGTGGGACC‑3’；

[0036] 鸡METTL14基因正反向引物7序列为：

[0037] F:5’‑CTGGATCTTGGCCGAGTGTG‑3’，

[0038] R:5’‑AGGCAGTGCTCCTTGGTTCT‑3’；

[0039] 以及鸡内参基因GAPDH正反向引物8序列为：

[0040] F:5’‑CGATCTGAACTACATGGTTTAC‑3’，

[0041] R:5’‑TCTGCCCATTTGATGTTGC‑3’。

[0042] 盖体侧壁上设有锁紧孔17；盒体侧壁上设有容纳腔11，容纳腔11内设置弹性件12，弹性件12自由端设置安装板13，安装板13上设有锁紧块14，锁紧块14伸入锁紧孔17内并在弹性件12的作用下，实现盖体2与盒体1的锁紧。

[0043] 本实用新型对盒体和盖体的锁紧结构进行改进，通过可移动的锁定块与锁定孔的配合，实现盖体的锁紧与开启；锁定块在弹性件的作用下，向前顶出，伸入锁定孔内，实现锁紧；按压弹性件内缩，带动锁紧块后移，即可开启盖体。

[0044] 安装板13下部设有按压部15；按压部15位于锁紧的盒体侧壁下方。本实用新型在安装板上设置按压部，方便对弹性件施力，且按压部隐藏在盒体侧壁下方，外端面不突出于盒体侧壁外侧面。

[0045] 按压部15、盒体侧壁相对端面上对应设有相配合的导向块16、导向槽18，保证盖体运动的一致性。

[0046] 上述RNA m6A甲基转移酶定量检测试剂盒的使用方法如下：

[0047] (1)组织或细胞RNA的抽提与纯化：从鸡组织或细胞中提取总RNA并纯化；

[0048] (2)cDNA第一链的合成：以步骤(1)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

[0049] (3)荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green染料法，以上述(2)合成的 cDNA第一链为模板，用提供的鸡METTL3基因特异性正反向引物6、鸡METTL14基因特异性正反向引物7、鸡内参基因GAPDH特异性正反向引物8，在荧光定量PCR仪上进行real time PCR扩增；

[0050] 本实用新型所述步骤(3)中real time PCR扩增的反应条件设置如下：

[0051] 95℃预变性10min；然后40个循环的95℃变性30s,退火56℃30s；最后95℃1min, 60℃30s,95℃30s。

[0052] 鸡组织或细胞样本经反转录成cDNA第一链后，对鸡METTL3基因、鸡METTL14基因和鸡内参基因GAPDH按照设定好的条件同时进行real time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以GAPDH基因为内参对照，对鸡METTL3基因和METTL14‑ΔΔCT基因mRNA表达水平进行校正，并采用2 法对数据进行处理，计算鸡 METTL3基因和METTL14基因mRNA相对表达量。

[0053] 实施例：鸡胸大肌和前背阔肌中METTL3基因和METTL14基因表达检测[0054] 采集成年文昌鸡胸大肌和前背阔肌样品，置于液氮速冻后转入‑80℃冰箱保存，采用Trizol 裂解法，从采集到的肌肉样本中提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照RT‑PCR试剂盒(Takara,Dalian,China)说明书反转录合成cDNA第一链。

[0055] 荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green I染料法，以上述合成的cDNA第一链为模板，设计的鸡METTL3基因和METTL14基因特异性正反向引物和鸡内参基因 GAPDH的特异性正反向引物，在Max3000P荧光定量PCR仪(爱普拜斯)上进行。即鸡肌肉样本总RNA反转录成cDNA第一链后，分别配置鸡METTL3基因、METTL14基因和内参基因GAPDH进行real‑time PCR扩增所需的反应体系，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。

[0056] 荧光定量PCR扩增体系配制见表1。

[0057] 表1荧光定量PCR扩增体系

[0058]

[0059]

[0060] 将每个样本的3个基因的扩增体系同时放入荧光定量PCR仪，进行PCR反应，real time PCR扩增的反应条件设置如下：

[0061] 95℃预变性10min；然后40个循环的95℃变性30s,退火56℃30s；最后95℃1min, 60℃30s,95℃30s。

[0062] 每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以GAPDH基因为内参对‑ΔΔCt照，对鸡METTL3基因和METTL14基因mRNA表达水平进行校正，并采用2 法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct目的基因‑Ct内参基因)，以胸大肌为对照组，计算METTL3基因和METTL14基因在胸大肌和前背阔肌中的相对表达量。

[0063] 胸大肌和前背阔肌中METTL3基因和METTL14基因的表达结果见图6。由图6可以看出，以慢肌纤维为主的前背阔肌中METTL3基因和METTL14基因的表达量均显著高于以快白肌纤维为主的胸大肌(P<0.05)。提示，METTL3基因和METTL14基因的表达与肌纤维类型密切相关。