[0001] 本实用新型涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测心丝虫的PCR检测试剂盒。

[0002] 心丝虫(学名Dirofilaria immitis，英语Heartworm)是一种经由蚊子叮咬患有心丝虫疾病的宠物而互相传播的线状寄生虫。心丝虫的幼虫寄生在全身的血液里，成虫可长
至30cm，寄生于心脏及肺动脉。当心丝虫缠绕在心脏内时，会干扰血液循环，使心脏发生肥
大、衰竭，并进一步影响肺脏、肝脏、肾脏功能，造成多处器官衰竭，严重可导致死亡。心丝虫
的主要宿主是狗，但它也会寄生在猫、狼、郊狼、胡狼、狐狸等动物体内；另外，雪貂、海狮等
动物也会受心丝虫感染。

[0003] 目前诊断检测心丝虫的方式包括：直接显微镜检查，和虫体抗原检验筛查，其中显微镜检是通过将动物血液直接在显微镜下观察判断是否染病，虫体抗原筛查是通过检测动
物体内的抗原来判断是否感染心丝虫。上述两种方法均需要相对较高的或特定性别的虫体
量才能检出，灵敏度相对较低。
实用新型内容

[0004] 本实用新型的目的在于提供检测心丝虫的PCR检测试剂盒，以解决现有技术中存在的心丝虫检测技术不够灵敏的技术问题。

[0005] 为实现上述目的，本实用新型提供了以下技术方案：

[0006] 本实用新型提供的检测心丝虫的PCR检测试剂盒，包括盒体、内衬和试剂瓶，所述盒体为六面体容器，其外表面包括顶侧、底侧和周侧，所述内衬位于所述盒体内部；所述内
衬上设置有定位孔，所述试剂瓶插设在所述定位孔内；

[0007] 所述试剂瓶包括PCR反应溶液管、耐热TaqDNA聚合酶溶液管、正向引物管、反向引物管、dNTP管以及阳性对照管和阴性对照管。

[0008] 通过采用PCR检测的方式对心丝虫进行检测，上述试剂可以实现对心丝虫遗传物质的有效扩增，通过对有限的遗传物质进行扩增能够放大检测信号，从而实现对心丝虫的
高灵敏度检测，同时检测速度极快，有助于对受到心丝虫感染的犬只等动物进行早期快速
诊断。

[0009] 在上述技术方案中，优选的，所述内衬和盒体之间设置有液态蓄冷剂。

[0010] 由于进行PCR检测时所需的部分试剂在低温环境下能够更好的保存而不影响其反应活性，且试剂瓶是插设在内衬上，而内衬位于盒体内，因此通过在内衬和盒体之间设置液
态蓄冷剂能够更好的保存试剂。

[0011] 在上述技术方案中，优选的，所述定位孔为圆柱形空腔。

[0012] 在上述技术方案中，优选的，还包括冷却插件，所述冷却插件为空心结构，其内部灌装有液态蓄冷剂，其顶部设置有顶面空腔，所述试剂瓶通过所述顶面空腔与所述冷却插
件相连，并插入所述定位孔内。蓄冷剂

[0013] 通过加设灌装液态蓄冷剂的冷却插件蓄冷剂能够更好的保持检测试剂的生物活性。

[0014] 在上述技术方案中，优选的，所述冷却插件具有向下延伸的并形成底面的侧面结构且侧面的高度小于所述试剂瓶的高度。

[0015] 在上述技术方案中，优选的，所述冷却插件的底面向上延伸形成底面空腔，所述底面空腔与位于所述冷却插件顶面的空腔内径相同。

[0016] 在上述技术方案中，优选的，所述底面空腔的高度小于所述顶面空腔的高度。

[0017] 在上述技术方案中，优选的，所述冷却插件的内侧壁上设置有硅胶圈。

[0018] 该硅胶圈便于对试剂瓶进行加固，从而使放置在冷却插件内的试剂瓶与冷却插件的结合更加稳定，不易从冷却插件中掉落。

[0019] 在上述技术方案中，优选的，所述内衬由透明材料制成。

[0020] 在上述技术方案中，优选的，不同的所述内衬上的所述定位孔的内径不完全相同。

[0021] 在上述技术方案中，优选的，所述蓄冷剂为凝胶蓄冷剂。

[0022] 在上述技术方案中，优选的，所述试剂瓶的高度和直径不完全相同。

[0023] 相比于现有技术，本实用新型提供了一种检测心丝虫的PCR检测试剂盒，该试剂盒包括盒体、内衬和试剂瓶，其中盒体位于最外侧，内衬位于盒体内部，试剂瓶插设在内衬上，
从而实现盒体对试剂瓶的收纳；其中内衬包括深内衬和浅内衬，两种内衬分别从试剂瓶的
底部和顶部对试剂瓶进行包裹固定，内衬和盒体内还存有蓄冷剂，该蓄冷剂能够使盒体内
维持一定的低温环境，从而保证试剂瓶内药物的生物活性。

[0035] 为使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本实用新型的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分实施例，而不是全部
的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前
提下所得到的所有其它实施方式，都属于本实用新型所保护的范围。

[0036] 在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图1所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的
方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。

[0037] 附图1是本实用新型检测心丝虫的PCR检测试剂盒的整体结构示意图；从图中可以清楚的看出，该装置主要包括盒体、内衬和试剂瓶三部分，其中试剂瓶的数量可以根据实际
需要进行增减调节。

[0038] 附图2是图1中的内衬的结构示意图；内衬的上表面设置有定位孔，该定位孔的截面为圆形，便于配合圆柱形设计的试剂瓶；当试剂瓶的形状设计为方形时，相应的，该定位
孔的截面也可以设计成方形；另外，定位孔的截面直径最好与试剂瓶的截面相配。

[0039] 附图3是本实用新型中冷却插件的结构示意图；冷却插件可以有多种结构，第一种是仅顶端开口，冷却插件具有一个顶面空腔，试剂瓶可以通过顶端的开口插入冷却插件内；
另一种是上下两端均设置有开口，冷却插件具有一个顶面空腔和底面空腔，试剂瓶通过顶
端开口插入冷却插件内。

[0040] 附图4是本实用新型中内衬和冷却插件相互结合后的第一种实施例的结构示意图；从该图中可以看出，冷却插件通过定位孔插入内衬。

[0041] 附图5是图4的截面示意图；从图中可以看出，该冷却插件的底面和侧面均为空心结构，其内部设置有液态蓄冷剂。

[0042] 附图6是本实用新型中内衬和冷却插件相互结合后的第二种实施例的结构示意图；从图中可以看出，此时的冷却插件与图4中明显不同。

[0043] 附图7是图6的截面示意图；冷却插件内包括顶面空腔和底面空腔，两个空腔之间的面内也设置有液态蓄冷剂。

[0044] 附图8是本实用新型中内衬和冷却插件相互结合后的第三种实施例的示意图；当需要对试剂进行叠放时，至少要有两个内衬，此时位于上方的内衬上的定位孔贯穿并连接
内衬的上下表面，其中上方的内衬位于下方内衬顶部，并恰好将插在下方内衬上的试剂瓶
顶端覆盖起来，从而实现对试剂瓶瓶盖的低温保存，另外，也能够使叠放的试剂瓶更加稳
定。

[0045] 附图9是心丝虫阳性对照与阴性对照洋菜凝胶电泳图；选用相应试剂进行试验后可以通过电泳图得到精确的检测结果。

[0046] 实施例1：

[0047] 如图1-5所示，本实用新型提供了一种检测心丝虫的PCR检测试剂盒，包括盒体1、内衬2和试剂瓶3，盒体1为六面体容器，其外表面包括顶侧、底侧和周侧，内衬2位于盒体1内
部；内衬2上设置有定位孔21，试剂瓶3插设在定位孔21内；

[0048] 试剂瓶3包括PCR反应溶液管、耐热TaqDNA聚合酶溶液管、正向引物管、反向引物管、dNTP管以及阳性对照管和阴性对照管。

[0049] 通过采用PCR检测的方式对心丝虫进行检测，上述试剂可以实现对心丝虫遗传物质的有效扩增，通过对有限的遗传物质进行扩增能够放大检测信号，从而实现对心丝虫的
高灵敏度检测，同时检测速度极快，有助于对受到心丝虫感染的犬只等动物进行早期快速
诊断。

[0050] 具体的，阴性对照管内盛放有无菌去离子水(ddH2O)。

[0051] 为了便于区分，设置阳性对照管为红色，阴性对照管为蓝色。颜色相反或者选用其他的颜色也可以，只要能起到区分两个对照管的作用即可。

[0052] 另外，反应时所用的正向引物管和反向引物管内的药品浓度为10μm，其相应的核苷酸序列为：

[0053] 正向引子SEQ 01序列为5’-TGATTGGTGGTTTTGGTAA-3’

[0054] 反向引子SEQ 02序列为5’-ATAAGTACGAGTATCAATATC-3’

[0055] 阳性对照管内为已经合成的心丝虫DNA片段。

[0056] 具体的，采用本申请中的试剂进行PCR反应时，其相应的PCR反应程序为：94℃2min；94℃30sec，53℃30sec，72℃1min，35cycle；72℃10min；4℃∞。

[0057] 具体反应时间约为150min。

[0058] 根据上述方式对待测样品进行PCR扩增，如果从待检测的样品中扩增到了689bp片段，则说明该检测样品中含有心丝虫。

[0059] 以感染心丝虫的犬只血液作为研究对象时，具体的操作过程如下：

[0060] 1、核酸提取

[0061] 选取感染心丝虫的犬只血液作为研究对象，以自动核酸萃取机MagPurix12S与9.2MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit萃取套组抽取DNA。

[0062] 萃取流程如下：将试剂包、一次性塑胶制品(Reaction Chamber、Tip Holder、Piercing Pin、Filtered Tip、Pestle)、Sample tube和Elute tube安装于实验架后，吸取
200μL检体注入Sample tube中，放入仪器；按下“Start”键后，选择萃取程序、检体体积及冲
提体积；确认LCD荧幕上显示正确程序后，按下“Enter”键，启动萃取程序；程序完成后提取
出的核酸可供PCR使用。

[0063] 2、PCR检测

[0064] PCR反应总体积25μl，PCR反应溶液2.5μl，正向引子1μl，反向引子1μl，10mM dNTP 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，萃取核酸5μl，ddH2O 13μl。

[0065] PCR反应程序为：94℃2min；94℃30sec，53℃30sec，72℃1min，35cycle；72℃10min；4℃∞。

[0066] 3、PCR产物进行2％洋菜凝胶电泳

[0067] 使用Biomate 100bp DNA Marker，PCR产物与DNA Marker混合DNA Fluorescence Dye后，上凝胶电泳，以照相系统拍照，得到图9，其中M代表Biomate 100bp DNA Marker，(-)
代表阴性对照，(+)代表阳性对照。

[0068] 当待测样品检测到与阳性对照位于同一序列位点的条带时，意味着该犬只已经感染心丝虫，反之则没有感染。

[0069] 另外，为了保证实验所需试剂的生物活性，作为可选地实施方式，内衬2和盒体1之间设置有液态蓄冷剂(蓄冷剂带有外包装，不会出现泄漏的情况)。

[0070] 由于进行PCR检测时所需的部分试剂在低温环境下能够更好的保存而不影响其反应活性，且试剂瓶3是插设在内衬2上，而内衬2位于盒体1内，因此通过在内衬2和盒体1之间
设置液态蓄冷剂能够更好的保存试剂。

[0071] 该液态蓄冷剂为相变蓄冷剂。

[0072] 作为可选地实施方式，定位孔21为圆柱形空腔。

[0073] 作为可选地实施方式，还包括冷却插件4，冷却插件4为空心结构，冷却插件4具有向下延伸的并形成底面的侧面结构且侧面的高度小于试剂瓶3的高度，其内部灌装有液态
蓄冷剂；具体的，本实施例中的冷却插件4的顶部设置有顶面空腔41，试剂瓶3通过顶面空腔
41与冷却插件4相连，并插入定位孔21内。

[0074] 通过加设灌装液态蓄冷剂的冷却插件4能够更好的保持检测试剂的生物活性。

[0075] 作为可选地实施方式，冷却插件4的内侧壁上设置有硅胶圈。

[0076] 该硅胶圈便于对试剂瓶3进行加固，从而使放置在冷却插件4内的试剂瓶3与冷却插件4的结合更加稳定，不易从冷却插件4中掉落。

[0077] 作为可选地实施方式，内衬2由透明材料制成。

[0078] 作为可选地实施方式，不同的内衬2上的定位孔21的内径不完全相同。

[0079] 作为可选地实施方式，蓄冷剂为凝胶蓄冷剂。

[0080] 作为可选地实施方式，试剂瓶3的高度和直径不完全相同。

[0081] 实施例2：

[0082] 如图6-7所示，本实施例2与实施例1的不同点在于：冷却插件4除了具有顶面空腔41之外，其底面向上延伸形成底面空腔42，底面空腔42与位于冷却插件4顶面的空腔内径相
同且上下对应设置，此时的冷却插件4的具体结构见图3B。

[0083] 为了更加稳定的固定试剂瓶3，作为可选地实施方式，底面空腔42的高度小于顶面空腔41的高度。

[0084] 此时的内衬2中的定位孔21贯穿设置在内衬2上，并连接内衬2的上下表面，由于内衬2和盒体1之前设置有液体蓄冷剂(蓄冷剂带有外包装，不会出现泄漏的情况)，因此也可
以将上述液体蓄冷剂放置在底面空腔42内，从而有助于保存试剂瓶3内的试剂。

[0085] 实施例3：

[0086] 如图8所示，本实施例中对试剂瓶3进行叠放处理，此时冷却插件4上的顶面空腔41和底面空腔42相互配合，分别从下方和上方对试剂瓶3进行包裹覆盖，从而进一步保证试剂
瓶3内药物的生物活性。

[0087] 该心丝虫PCR检测试剂盒与现有的检测技术相比，具有以下优点：

[0088] 1、检测速度快，效率高，可根据需要检测病原体。

[0089] 2、灵敏度高，适用于早期诊断，对早期心丝虫传染所引起的犬只血液循环障碍症候群检测效果较好。

[0090] 3、特异性强，只针对心丝虫之特定DNA片段进行扩增，其他寄生虫、细菌或病毒不能被扩增；由于引物仅对心丝虫的特定DNA片段特异性结合，因此特异性强、准确率高。

[0091] 以上所述，仅为本实用新型的具体实施方式，但本实用新型的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本实用新型揭露的技术范围内，可轻易想到变化
或替换，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。因此，本实用新型的保护范围应以所述权
利要求的保护范围为准。