[0001] 本实用新型属于生物技术领域，尤其涉及鸡CPT1A基因表达荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法，主要用于鸡CPT1A基因表达调控和脂肪酸氧化相关的功能研究。

[0002] 脂肪酸氧化是脂酸的分解代谢、供能，它是影响肝脏内脂肪含量的一个重要因素，脂肪酸氧化功能地绝对和相对降低均可导致肝脏脂质沉积。脂肪酸的氧化包括β氧化和ω氧化，其中β氧化发生在线粒体和过氧化物酶体，ω氧化发生在微粒体(即内质网)。肉碱转移酶1A (CPTlA)是催化脂酸ω氧化的关键酶。CPTlA活性与生理状态密切相关：饥饿、高脂低糖饮食或糖尿病时，机体不能利用糖，需要脂肪酸供能，则CPTlA活性增强，脂酸氧化增强以利于供能；反之，饱食后脂肪合成增加，其中间产物一丙二酰辅酶A水平增高，可抑制CPTlA 的活性，因而脂肪酸氧化受抑。CPT1A在能量代谢中具有重要作用，它与心肌肥厚、糖尿病等许多代谢疾病的发生发展有密切的关系，对它的深入研究将为脂代谢相关疾病的药物治疗提供新的思路。肉鸡是动物蛋白的主要来源之一，肉鸡的体脂是肉鸡产业的主要关注点之一，肉鸡可以作为研究能量代谢和生长发育等的模型。因此，研究CPT1A基因的表达调控对于了解肉鸡脂肪酸氧化和脂质代谢调控机理具有重要意义，为研究肿瘤和代谢性疾病提供一定的参考。

[0003] 实时荧光定量PCR技术具有高敏感性、高特异性和重复性好等优点，与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)相结合使定量极微量的基因表达成为可能，广泛用于基因表达、基因芯片结果验证、病原体定性与定量、SNP检测等方面研究。实用新型内容

[0004] 为了解决以上技术问题，本实用新型提供一种鸡CPTlA基因表达荧光定量RT-PCR检测试剂盒，本实用新型试剂盒准确性高、快速、价格低廉，通过建立实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡CPT1A基因表达的方法，为研究鸡CPT1A表达调控以及脂质代谢调控奠定基础，具有潜在的应用价值和社会效应。

[0005] 本实用新型的目的是通过以下技术方案实现的，一种鸡脂质代谢合成相关的脂肪酸合成酶基因荧光定量RT-PCR试剂盒，试剂盒内设有衬垫、SYBR Green Master热启动荧光PCR 混合物、鸡CPT1A基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物、dNTP、灭菌DEPC水。

[0006] 其中，鸡CPT1A基因正反向引物序列为：

[0007] F:5，—CGAGTCAGACACCACAGCAACAC—3，

[0008] R:5，—CACCGTAACCATCATCAGCCACAG—3；

[0009] 以及鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物序列为

[0010] F:5’—GTCCACCGCAAATGCTTCT—3’，

[0011] R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。

[0012] CPT1A和β-actin基因PCR扩增片段分别为99bp和58bp。

[0013] 优选的，所述试剂盒的盒体包括第一盒体、第二盒体、锁紧装置；

[0014] 所述第一盒体为方形体结构，包括底板，底板两端设置第一侧壁、第二侧壁，第一侧壁上设置第一盖板，第二侧壁上设置第二盖板；第一盖板上设有第一避让槽；第二盖板上设有第二避让槽，第一避让槽、第二避让槽朝向相反；当试剂盒封闭时，第二避让槽位于第一避让槽上方，且两者之间交叉设置；第一避让槽、第二避让槽用于避让锁紧装置；

[0015] 第二盒体内设置所述SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物、鸡CPT1A基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物、dNTP、灭菌DEPC水；第二盒体内设有螺杆导向孔；第二盒体上设有相对设置的第三盖板、第四盖板；

[0016] 锁紧装置包括压紧件、螺杆、螺母，螺母设置在第一盒体底板内，螺杆下端穿过第二盒体内的螺杆导向孔并与螺母螺纹连接；螺杆上端设置压紧件。

[0017] 优选的，所述第三盖板、第四盖板结构相同，第三盖板的宽度小于螺杆导向孔与第三盖板之间的垂直距离。

[0018] 优选的，所述第一盖板、第二盖板的长度大于试剂盒长度的一半。

[0019] 优选的，所述压紧件的长度小于第一、二避让槽的长度，压紧件的宽度小于第一、二避让槽的宽度。

[0020] 优选的，所述锁紧装置为塑料件。

[0021] 优选的，所述螺杆导向孔四周设置SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物、鸡CPT1A 基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物、dNTP、灭菌 DEPC水，SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物、鸡CPT1A基因表达的特异性正反向引物、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物、dNTP、灭菌DEPC水组成等边五边形结构。

[0022] 上述鸡脂质代谢相关的脂肪酸氧化相关的CPT1A基因荧光定量RT-PCR试剂盒的使用方法如下：

[0023] (1)组织RNA的抽提与纯化：从鸡组织中提取总RNA并纯化；

[0024] (2)cDNA第一链的合成：以步骤(1)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA 第一链；

[0025] (3)荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green I燃料法，以上述(1)设计的 CPT1A正反向引物和β-actin基因正反向引物和(2)合成的cDNA第一链为模板，在荧光定量PCR仪上进行；

[0026] (4)溶解曲线分析

[0027] 步骤(4)反应后的溶解曲线分析中，CPT1A和β-actin基因均只有一个特异性峰，溶解温度分布为80.5℃和81.5℃，则说明设计的CPT1A引物具有较好的特异性，可以用来 CPT1A基因定量表达分析。

[0028] 本实用新型所述步骤(3)和(4)中real time PCR扩增的反应条件设置如下：

[0029] CPT1A：95℃预变性30s,然后35个循环的94℃变性25-30s,退火55-60℃ 25-30s, 最后95℃变性10-15s,60℃ 1min,94℃ 10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

[0030] β-actin：94℃预变性30s,然后35个循环的94℃变性20-30s,退火56-59℃ 20-30s,最后95℃变性10-15s,60℃ 1min,94℃ 10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

[0031] 鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，分别利用CPT1A和β-actin基因基因各自优化好的条件进行real time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照 (NTC)。以β-actin基因为内参照，对CPT1A基因mRNA表达水平进行校正，并采用2-ΔΔCt法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)，以一种组织，比如腿肌ΔCt作为其他组织的参照，计算相对表达量ΔΔCt，ΔΔCt＝(ΔCtX group–ΔCt参照)，以此来比较CPT1A基因表达量的倍数变化。

[0032] 与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：

[0033] 第一，CPT1A荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法，准确性可靠、快速、特异性强、价格低廉，具有灵敏度高、自动化程度高，无污染、实时性好等优点。

[0034] 第二，肉碱脂酰转移酶1A(carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A)是催化脂酸ω氧化的关键酶。CPTlA活性与生理状态密切相关：饥饿、高脂低糖饮食或糖尿病时，机体不能利用糖，需要脂肪酸供能，则CPTlA活性增强，脂酸氧化增强以利于供能；反之，饱食后脂肪合成增加，其中间产物一丙二酰辅酶A水平增高，可抑制CPTlA的活性，因而脂肪酸氧化受抑。因此，研究CPT1A基因的表达调控对于了解肉鸡脂肪酸氧化和脂质代谢调控机理具有重要意义。

[0035] 第三，本研究通过建立实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡CPT1A基因表达的方法，为研究及CPT1A表达调控以及脂肪酸氧化代谢调控奠定基础，为优质肉鸡育种提供理论依据，同时为研究肿瘤和代谢性疾病提供一定的参考。

[0036] 第四，本实用新型将盒体设计为内、外双层结构，第一盒体设计为U形结构，第一盒体内设置第二盒体，第一、二盒体通过螺杆连接在一起。当需要封闭盒体时，此时旋转锁紧装置，使得压紧件与避让槽平行设置，将第三、四盖体盖盖上，接着将第一、二盖体盖上，旋转压紧件90°，使得压紧件与避让槽垂直设置，此时压紧件锁紧第一、二、三、四盖体。当需要打开盒体是，旋转压紧件90°，使得压紧件与避让槽平行设置，打开第一、二盖体，由于采用避让槽结构，使得第一二盖体不会受到锁紧装置的妨碍，接着打开第三、四盖体，取出试剂。

[0037] 第五，本实用新型锁紧装置的螺杆位于第二盒体内部中心位置，五个试剂位于螺杆周围，呈等边五边形结构，使得螺杆的存在不会干扰到五个试剂的取出和放回。螺杆螺母结构，具有自锁功能，使得锁紧效果好，不会造成运输过程中盒体的开启。锁紧装置采用塑料件，质轻价廉。

[0051] 结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。

[0052] 实施例：CPT1A基因在清远麻鸡公母鸡不同组织中差异表达量分析

[0053] 清远麻鸡属于肉用型地方品种，以体型小肉品质优良、皮下和肌内脂肪发达而著名180 日龄公鸡体重为1600g，母鸡为l300g，屠宰性能较好，半净膛率平均为85％，全净膛宰率平均为76％，阉公鸡半净膛为85％，全净膛77％。清远麻鸡配套利用优势明显等优点，受到国内外很多养殖户的青睐。

[0054] 利用常用的Trizol裂解法，从180日龄的清远麻鸡公母鸡的心脏、肝脏、下丘脑、胸大肌、腓肠肌、锁骨下脂肪、腹脂、皮下脂肪中提取总RNA，以提取的总RNA为模板，按照 RT-PCR试剂盒(Takara,Dalian,China)说明书反转录合成cDNA第一链。

[0055] 如图3-10所示，一种鸡CPT1A基因表达荧光定量试剂盒，包括盒体、衬垫26、SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物21、鸡CPT1A基因表达的特异性正反向引物22、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物23、dNTP 24、灭菌DEPC水25。

[0056] 试剂盒的盒体包括第一盒体1、第二盒体2、锁紧装置3。

[0057] 第一盒体1为方形体结构，包括底板11，底板11两端设置第一侧壁12、第二侧壁13，第一侧壁12上设置第一盖板14，第二侧壁13上设置第二盖板15；第一盖板14上设有第一避让槽141；第二盖板15上设有第二避让槽151，第一避让槽141、第二避让槽151朝向相反；当试剂盒封闭时，第二避让槽151位于第一避让槽141上方，且两者之间交叉设置；第一避让槽141、第二避让槽151用于避让锁紧装置。

[0058] 第二盒体2内设置所述SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物21、鸡CPT1A基因表达的特异性正反向引物22、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物23、dNTP24、灭菌DEPC水25；第二盒体2内设有螺杆导向孔29；第二盒体2上设有相对设置的第三盖板 27、第四盖板28。

[0059] 锁紧装置包括压紧件31、螺杆32、螺母33，螺母设置在第一盒体1底板内，螺杆下端穿过第二盒体2内的螺杆导向孔29并与螺母33螺纹连接；螺杆32上端设置压紧件31。螺杆螺母结构，具有自锁功能，使得锁紧效果好，不会造成运输过程中盒体的开启。锁紧装置采用塑料件，质轻价廉。

[0060] 本实用新型将盒体设计为内、外双层结构，第一盒体设计为U形结构，第一盒体内设置第二盒体，第一、二盒体通过螺杆连接在一起。当需要封闭盒体时，此时旋转锁紧装置，使得压紧件与避让槽平行设置，将第三、四盖体盖盖上，接着将第一、二盖体盖上，旋转压紧件90°，使得压紧件与避让槽垂直设置，此时压紧件锁紧第一、二、三、四盖体。当需要打开盒体是，旋转压紧件90°，使得压紧件与避让槽平行设置，打开第一、二盖体，由于采用避让槽结构，使得第一、二盖体不会受到锁紧装置的妨碍，接着打开第三、四盖体，取出试剂。

[0061] 第三盖板27、第四盖板28结构相同，第三盖板27的宽度小于螺杆导向孔29与第三盖板27之间的垂直距离。第一盖板14、第二盖板15的长度大于试剂盒长度的一半。压紧件31的长度小于第一、二避让槽141、151的长度，压紧件31的宽度小于第一、二避让槽 141、151的宽度。

[0062] 螺杆导向孔29四周设置SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物21、鸡CPT1A基因表达的特异性正反向引物22、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物23、dNTP24、灭菌DEPC水25，SYBR Green Master热启动荧光PCR混合物21、鸡CPT1A基因表达的特异性正反向引物22、鸡内参基因β-actin表达的特异性正反向引物23、dNTP24、灭菌DEPC水 25组成等边五边形结构。本实用新型锁紧装置的螺杆位于第二盒体内部中心位置，五个试剂位于螺杆周围，呈等边五边形结构，使得螺杆的存在不会干扰到五个试剂的取出和放回。

[0063] 检测方法中CPT1A荧光定量RT-PCR条件的优化：

[0064] (1)引物设计：根据GenBank上登录的鸡CPT1A和β-actin基因mRNA序列，利用 Primer5.0和oligo6.0设计一种采用荧光定量RT-PCR检测清远麻鸡CPT1A基因表达的特异性引物，经过引物筛选与条件优化，最终选择出符合荧光定量PCR反应特点的CPT1A基因特异性正反向引物

[0065] F:5，—CGAGTCAGACACCACAGCAACAC—3，

[0066] R:5，—CACCGTAACCATCATCAGCCACAG—3；

[0067] 以及作为内参基因的鸡β-actin基因特异性正反向引物

[0068] F:5—GTCCACCGCAAATGCTTCTAA—3’，

[0069] R:5’TGCGCATTTATGGGTTTTGTT—3’。

[0070] (2)组织RNA的抽提与纯化：从清远麻鸡组织中提取总RNA并纯化；

[0071] (3)cDNA第一链的合成：以步骤(2)中所提取的RNA为模板，反转录合成cDNA 第一链；

[0072] (4)荧光定量real time PCR扩增反应：采用SYBR Green I燃料法，以上述(1)设计的CPT1A正反向引物和β-actin基因正反向引物和(3)合成的cDNA第一链为模板，在ABI7500 fast荧光定量PCR仪上进行。即清远麻鸡各组织样本总RNA反转录成cDNA第一链后，分别利用CPT1A和β-actin基因各自优化好的条件进行荧光定量RT-PCR反应，每个样品均做3 个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。

[0073] 荧光定量PCR扩增体系配制如下

[0074]

[0075] real time PCR扩增的反应条件设置如下：

[0076] CPT1A：94℃预变性20-30s,然后35个循环的94℃变性20-30s,退火55-60℃ 20-30s,最后94℃变性10-15s,60℃ 1min,94℃ 10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

[0077] β-actin：94℃预变性20s,然后35个循环的94℃变性20-30s,退火56-59℃ 20-30s, 最后94℃变性10-15s,60℃ 1min,95℃ 10-15s，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。

[0078] 为检测反应的特异性，在real-time反应后，进行溶解曲线分析，以确定得到的产物为目的产物。扩增温度以0.5℃的增幅从60℃缓慢递增到94℃，连续测定样品的荧光强度以获取溶解曲线。结果显示如图1，CPT1A和β-actin基因均只有一个特异性峰，溶解温度分别为 80.5℃和81.5℃。则设计的CPT1A引物有很好的特异性，可以进行CPT1A基因定量分析。

[0079] 清远麻鸡CPT1A在不同组织中差异表达分析

[0080] 清远麻鸡各组织样本经反转录成cDNA第一链后，分别利用CPT1A和β-actin基因基因各自优化好的条件进行real time PCR反应，每个样品均做3个平行管，每次反应均设无模板对照(NTC)。以β-actin基因为内参照，对CPT1A基因mRNA表达水平进行校正，并采用 2-ΔΔCt法对数据进行处理，其中ΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)，以一种组织，比如腿肌ΔCt 作为其他组织的参照，计算相对表达量ΔΔCt，ΔΔCt＝(ΔCt(组织)–ΔCt(腿肌)，以此来比较CPT1A基因相对表达量。结果见图2。

[0081] 由图2可以看出，CPT1A基因表达在公母鸡同一组织表达量差异不显著。CPT1A基因在肝脏的表达量显著高于在其他组织(心脏、肝脏、下丘脑、胸大肌、腓肠肌、腹脂、锁骨下脂肪、皮下脂肪)中的表达量，在其他组织中公母鸡CPT1A mRNA表达量无显著差异。说明清远麻鸡肝脏在脂质代谢的脂肪酸氧化过程中发挥重要作用。

[0082] 本实用新型从实时荧光定量RT-PCR技术检测鸡CPT1A基因表达的方法，为研究鸡 CPT1A表达调控以及脂肪酸氧化过程和脂质代谢调控奠定基础，为优质肉鸡育种和提供理论依据，同时为研究肿瘤和代谢性疾病提供一定的参考。