[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种巴马小型猪睾丸发育动态变化观察方法。

[0002] 巴马香猪是我国广西地区的一种小型猪种，产于巴马瑶族自治县，因其两头为黑色，中间为白色的特性，当地人也称其为“两头乌”，也被称做“冬瓜猪”、“芭蕉猪”。巴马香猪具有肌内脂肪丰富、肉质细嫩、肥而不腻及不饱和脂肪酸丰富等鲜明的肉质特点，被消费者所追捧，有山珍果子狸的美称，是制备烤乳猪和腊全猪的上乘原料，以肉味香浓著称于世。巴马香猪体型较小，成年母猪平均体重36.50kg，巴马香猪还具有适应性强，耐粗饲料，抗病能力强等特点。而因其产区交通不便，当地群众多采用留子配母的配种方式进行繁殖，在长期近亲交配与当地饲养条件影响下，其基因纯合度较高，隐形不利基因逐渐淘汰，遗传性能稳定，加强了性早熟、体小肉香的特点。

[0003] 巴马香猪性成熟早，公猪的初配年龄平均为75.75±2.60天。母猪性成熟年龄平均为120.08±2.31天，公猪为67±8.40天。母猪初配年龄绝大部分在5～6月龄，平均为159.28±20.60天，母猪发情周期平均19.92±1.20天[2]。其性早熟的繁殖特性也使其成为研究性早熟遗传机理的良好素材。

[0004] 目前针对广西巴马小型猪睾丸发育的研究内容主要是：运用二代测序、10×Genomics及三代测序技术，对不同猪种、不同发情阶段、不同日龄的地方猪睾丸组织进行了测序与组装，鉴定出与地方猪睾丸发育相关的差异基因、RNA分子、蛋白以及相关通路。

[0005] 上述研究方案主要是针对外来猪种与部分地方猪睾丸组织进行不同RNA的鉴定和表达分析，建立文库，分析发现这些靶因子主要富集于睾丸发育和精子生成相关的GO和KEGG信号通路中，为地方猪睾丸发育提供了借鉴意义。

[0037] 下面通过实施例对本发明做进一步地详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。

[0038] 如图1‑4所示，一种巴马小型猪睾丸发育动态变化观察方法，所述发育动态变化观察包括以下步骤：

[0039] (1)采集睾丸组织，包括采集巴马小型猪胚胎期65～105d和出生后0～300d的睾丸组织，测定睾丸不同发育阶段的各项形态学指标，通过HE染色观察其组织特征，并测定出生后不同日龄的生殖激素水平。

[0040] 形态学指标包括睾丸长径、短径、厚径与重量。

[0041] 生殖激素包括促性腺激素释放激素、黄体生成素、卵泡刺激素、酮。

[0042] 需要说明的是，巴马小型猪是广西特有的小型猪种，具有体型小、性早熟、遗传稳定等特点。

[0043] 将巴马小型猪睾丸的发育时期设为15个时期，分别为胚胎期65、90、105d和出生后0、30、35、40、45、60、90、120、150、180、300d及出生后的6年；并采集各发育时期对应的巴马小型猪睾丸组织。

[0044] 需要说明的是，15个发育时间的各自对应编号为：

[0045] 巴马小型猪胚胎期65d(E65)、90d(E90)、105d(E105)。

[0046] 出生后0d(D0)、30d(D30)、35d(D35)、40d(D40)、45d(D45)、60d(D60)、90d(D90)、120d(D120)、150d(D150)、180d(D180)、300d(D300)、6年(Y6)。

[0047] (2)采用分子生物学标记物，结合免疫荧光及RT‑qPCR技术，对巴马小型猪睾丸中的精原细胞、支持细胞和间质细胞进行深入研究。分子生物学标记物包括猪未分化精原细胞的分子标记物、增殖细胞标记物、生殖细胞的细胞质中表达的分子标记物、睾丸支持细胞的分子标记物、睾丸间质细胞的分子标记物。

[0048] 可理解的是，猪未分化精原细胞的分子标记物包括UCHL1；增殖细胞标记物包括Ki‑67、PCNA；猪生殖细胞的细胞质中表达的分子标记物包括DDX4；猪睾丸支持细胞的分子标记物包括SOX9；睾丸间质细胞的分子标记物包括CYP17A1。

[0049] (3)对不同发育阶段的睾丸组织进行转录组测序分析。利用巴马小型猪不同发育时期的睾丸组织转录组测序数据标准化后获取得基因表达FPKM值，借助TBtools中基于R包的WGCNA shiny插件完成加权基因共表达网络分析。

[0050] 转录组测序分析包括链特异性转录组测序、荧光定量PCR验证、RNA‑seq数据质控统计、样品相关性和聚类分析、差异分析与差异基因富集分析、基于差异基因的时序分析、加权网络共表达分析及时序分析与WGCNA联合筛选不同发育阶段核心基因。

[0051] (4)通过巴马小型猪睾丸组织的cDNA克隆基因片段，构建真核表达载体，并对FRS2基因序列进行生物信息学分析。

[0052] FRS2基因调节巴马小型猪睾丸间质细胞的发育及分泌睾酮、影响性早熟。

[0053] 在本公开的一些实施例中，给出了一种真核表达载体的构建方法，构建方法包括[0054] (1)总RNA，提取睾丸组织的总RNA；

[0055] (2)获取目的片段cDNA，将提取的睾丸组织总RNA进行反转录，此逆转录反应获得的cDNA可直接作为PCR反应的模板使用；

[0056] (3)克隆引物设计，采用同源重组的方式连接目的片段与空载质粒；

[0057] (4)克隆技术，通过克隆技术得到质粒，并进行质粒双酶切鉴，鉴定正确的质粒放‑80℃保存。

[0058] 克隆技术具体如下：

[0059] (1)使用克隆引物进行普通PCR扩增目的片段，反应体系和反应程序如下。PCR反应体系为：Taq酶25μL、FRS2_L1527_F 2.5μL、FRS2_L1527_R 2.5μL、cDNA 5μL、RNase Free dH2O 15μL。

[0060] PCR循环反应程序如下：

[0061]

[0062] (2)将扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，检测其是否为所需目的片段，并将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。鉴定正确的使用胶回收试剂盒TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)回收纯化目的片段。

[0063] (3)将pEGFP‑N1载体使用HindⅢ和KpnⅠ酶和buffer M于PCR仪中，设定37℃1h 30min进行双酶切，形成两端具有黏性末端的线性载体并回收纯化pEGFP‑N1线性化片段(Code No.9762)。

[0064] (4)配制重组反应体系，载体片段使用量和插入片段使用量根据说明书计算最佳连接反应计算。37℃反应30min后立即置于冰上冷却。

[0065] 反应体系如下：

[0066]

[0067] (5)在冰上解冻克隆感受态细胞(DH5αCompetent cell，Vazyme#C502)；

[0068] (6)将10μL重组产物加入100μL Trans 5α感受态细胞，混匀，冰上静置30min，42℃水浴45s，冰上冷却2min后加入900μL的SOC培养基，37℃摇床(250rpm)摇菌1h后5000rpm离心5min弃900μL上清，菌体重悬后用无菌涂布棒将其在含有卡那霉素的LA平板上涂抹均匀，置于37℃培养箱中正放0.5h后，倒置过夜培养。

[0069] (7)从LA平板中挑取数个单菌落分别加入到50μL无酶无菌水中，摇匀，制备数个菌液。

[0070] (8)使用FRS2_L1527_F作为上游引物，EGFP‑N(载体通用引物)作为下游引物或CMV‑F(载体通用引物)作为上游引物，FRS2_L1527_R作为下游引物进行交叉引物的菌液PCR，挑选鉴定阳性的菌液进行扩菌，并测序。

[0071] 引物序列所示：

[0072]

[0073] (9)将鉴定正确的菌液50μL加入装有250mL LB培养基(按照抗生素：培养基1：1000加入卡那霉素)的锥形瓶中，在37℃200rpm摇床过夜。并取1mL的菌液按照菌液：50％甘油＝1：1的比例进行保种，储存在‑80℃。

[0074] (10)根据无内毒素质粒超大量提取试剂盒Endo‑Free Plasmid Mega Kit D6228提取用于转化级别的无内毒质粒。

[0075] (11)将提取好的质粒进行质粒双酶切鉴定，酶切步骤同(3)，鉴定正确的质粒放‑80℃保存。

[0076] 本发明从巴马小型猪睾丸组织中成功克隆了FRS2基因的CDS序列，并构建了其真核表达载体，CDS全长1527bp，共编码508个氨基酸。对该基因进行生物信息学分析、实时荧光定量PCR、Western Blot蛋白检测和免疫组化分析，获得了该基因在转录和翻译水平上睾丸不同发育时间的表达趋势和空间表达特性。

[0077] (1)FRS2基因CDS全长1527bp，预测编码一个不稳定的膜外亲水性蛋白，氨基酸序列在各物种间表现出较高的进化保守性，预测该蛋白在睾丸间质细胞和卵巢颗粒细胞中高表达。

[0078] (2)FRS2基因表达分析结果显示，该基因主要表达于性腺轴组织中；FRS2基因在睾丸中主要表达于间质细胞的细胞质和细胞膜中，少量表达于精原细胞、各类生精细胞和精子中，在梭形肌样细胞和支持细胞中不表达。

[0079] (3)FRS2基因转录水平的表达趋势与类固醇激素合成相关基因的表达趋势极显著正相关，且FRS2蛋白与CYP17A1蛋白以及与睾丸物理参数之间均有极显著的正相关关系。

[0080] 可理解的是，FRS2基因在调节巴马小型猪睾丸间质细胞的发育及分泌睾酮、影响性早熟方面发挥作用。

[0081] 在本公开的一些实施例中，给出了一种加权基因共表达网络分析方法包括以下步骤：

[0082] a.上传基因表达矩阵，并在初步筛选时设置样本百分比阈值为0.5，表达值阈值为1，然后使用基于中值绝对偏差的方法进行二次筛选，最终保留12000个基因用于后续分析；

[0083] b.使用样本外群值检测功能构建样本聚类树，检测并剔除离群样本；

[0084] c.为构建无尺度共表达网络，选择拓扑阈值时，在满足无尺度特性的前提下，计算得出β＝20作为最佳软阈值；

[0085] d.在构建基因模块网络时，设置最小模块大小为50，模块合并剪裁高度为0.25，从而生成分层聚类树状网络拓扑结构，根据该合并高度对基因模块进行重新组合，以获得更为稳定的基因集群；

[0086] e.获得模块特征基因与不同生长日龄的相关系数r，|r|越接近1且P‑value值越小，则模块内基因与巴马小型猪睾丸不同日龄之间的相关性就越显著。

[0087] 本发明，对15个不同发育时期巴马小型猪睾丸组织进行转录组链特异性文库测序，通过样本相关性分析、主成分分析、差异表达分析、时序分析、加权基因共表达网络分析(WGCNA)和富集分析，筛选出各发育阶段的核心基因。

[0088] 具体地，将15个发育时期分为5个发育阶段，并筛选出各阶段影响睾丸发育的核心基因；其中，胚胎中期的核心基因包括COL1A1、COL1A2、COL3A1、BGN、SPP1；胚胎后期的核心基因包括SOX9、GATA4、AMH、CXCL12、CXCL10；初情期启动的核心基因包括CDK1、KIF4A、BUB1B、TOP2A、DAZL；性成熟期的核心基因包括SPATA19、NME8、DNAH1、AKAP4、SPA17；老年期的核心基因包括CYP11A1、CYB5A、FDX1、EGFR、SREBF1。可理解的是，5个发育阶段的核心并非仅限于此。

[0089] 5个发育阶段为：E65(胚胎中期)、D90～D0(胚胎后期)、D30～D45(初情期启动)、D60～D300(性成熟期)、Y6(老年期)。

[0090] 5个发育阶段的核心基因如下表1所示。

[0091] 表1巴马小型猪睾丸不同发育阶段核心基因

[0092]

[0093] 5个发育阶段中的胚胎中期(E65)核心基因的FPKM表达量变化如下表2所示。

[0094] 表2胚胎中期(E65)核心基因的FPKM表达量变化

[0095]

[0096] 续表2胚胎中期(E65)核心基因的FPKM表达量变化

[0097]

[0098] 5个发育阶段中的胚胎后期(E90‑D0)核心基因的FPKM表达量变化如下表3所示。

[0099] 表3胚胎后期(E90‑D0)核心基因的FPKM表达量变化

[0100]

[0101] 续表3胚胎后期(E90‑D0)核心基因的FPKM表达量变化

[0102]

[0103] 5个发育阶段中的初情期启动(D30‑D45)核心基因的FPKM表达量变化如下表4所示。

[0104] 表4初情期启动(D30‑D45)核心基因的FPKM表达量变化

[0105]

[0106] 续表6初情期启动(D30‑D45)核心基因的FPKM表达量变化

[0107]

[0108] 5个发育阶段中的性成熟期(D60‑D300)核心基因的FPKM表达量变化如下表6所示。

[0109] 表6性成熟期(D60‑D300)核心基因的FPKM表达量变化

[0110]

[0111] 续表6性成熟期(D60‑D300)核心基因的FPKM表达量变化

[0112]

[0113] 5个发育阶段中的性成熟期(D60‑D300)核心基因的FPKM表达量变化如下表7所示。

[0114] 表7老年期(Y6)核心基因的FPKM表达量变化

[0115]

[0116] 可理解的是，筛选出的核心基因均与睾丸组织结构发育、性别分化与体细胞发育、细胞周期与减数分裂过程、生精活动和精子发育、类固醇激素合成与分泌有关。

[0117] 根据上述可知，在E65时，睾丸内可见少量的曲细精管和未分化的精原细胞、支持细胞；未分化的精原细胞在出生前均具有增殖特征，在出生后D30时已分化，其数量在D0～D30呈快速增长；支持细胞在E90～D0阶段具有增殖特征，其数量在E90～D30阶段持续增加，在D30后已分化成熟并数量趋于稳定；在E90时出现成熟的间质细胞，间质细胞标志基因在Y6阶段表达量最高，Y6时期各类生殖细胞、支持细胞标志基因均无表达；精子标志基因在D40时开始表达，减数分裂和精原细胞分化标记基因在D30时开始表达。

[0118] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。