技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及林蛙特异性序列、引物及利用其鉴定林蛙或林蛙油的方法。
相关背景技术
[0002] 林蛙俗称“哈士蟆”，不仅能大量捕食森林、牧草和农作物的害虫，而且是中国药、肉兼用的蛙类，因而林蛙是中国的重要经济动物之一。东北林蛙的整体或雌蛙输卵管的干制品，均可入药，即称哈士蟆和哈士蟆油，是中国传统的名贵中药材之一。一般用作滋补强身，治疗体弱气虚、神经衰弱、病后失调等病症。林蛙油作为传统而名贵的中药材，因其价格高昂，市场上同属和混伪品较多，因此，林蛙油的真伪鉴别更加的重要。传统的林蛙油鉴别方法主要是来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定，这些以形态学为基础的鉴别方法简便、易行，是行之有效的林蛙油鉴别方法。但这些鉴别方法是以林蛙油的遗传表现型为基础而建立起来的，不仅受到遗传因素的影响，而且与中国林蛙的生长发育阶段、自然环境及人类活动等有着密切的关系，其遗传表现型的变异性较大，同时在鉴别过程中容易受主观因素的影响，存在重复性和稳定性较差等问题，从而影响鉴定结果的可靠性。相比之下，利用DNA分子特征作为遗传标记进行中药鉴定更为准确可靠，非常适用于由近缘物种、易混淆物种、珍稀物种等获得的中药药材的鉴定。因此，寻找林蛙的DNA分子特征对于林蛙油的鉴定具有重要意义。
具体实施方式
[0036] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
[0037] 实施例1：林蛙特异性序列COI的获得
[0038] 石林春等人利用DNA条形码技术建立了林蛙油及其混伪品的DNA条形码物种鉴定数据库，依据COI基因经基因测序验证能够鉴别市售林蛙油的真伪。以提取的林蛙组织样品DNA为模板，COI特异性序列为上下游引物，使用2×Es Taq Master Mix酶进行PCR扩增。PCR扩增后进行凝胶电泳，条带大小与文献中报道的COI序列大小一致。将PCR产物进行测序，获得655bp林蛙特异性COI序列(见图1)，该序列的核苷酸序列见SEQ ID NO.1。
[0039] SEQ ID NO.1：
[0040] CAACCTATCTTCGGGGCTGAGCCGGCATGGTCGGAACAGCCCTAAGCCTTCTTATTCGAGCAGAATTAAGCCAACCGGGAACTCTCTTGGGGGACGACCAGATCTACAAT GTTATCGTCACTGCCCACGCATTTGTAATGATTTTCTTTATAGTCATACCAATCCTAATCGGGGGCTTTGGTAACTGACTAATCCCCATGATGATTGGAGCCCCTGACATAGCCTTCCCCCGGATAAATAATATGAGCTTCTGGCTACTCCCACCATCCTTCTTTCTCCTCTTAGCCTCCTCTACAGTTGAAGCTGGAGCAGGTACAGGCTGAACAGTCTATCCCCCTTTAGCTAGCAACCTAGCCCACGCGGGCCCATCGGTAGACCTAGCCATCTTCTCGCTACACCTGGCCGGGGTATCATCAATCCTGGGGGCAATCAATTTTATTACAACAATTATTAATATAAAACCCGCATCCACAACACAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCTGTTCTGATCACTGCTGTACTCCTGCTTCTTTCTCTCCCAGTCCTAGCCGCTGGAATTACCATACTTCTCACAGACCGAAATCTAAACACCACCTTTTTCGACCCTGCAGGGGGAGGAGACCCAGTTCTCTACCAACACCTATTCTGATT
[0041] 实施例2：扩增林蛙特异性序列COI中部分片段的引物对
[0042] 根据引物设计原则，使用Primer5.0设计林蛙特异性序列COI的引物，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物。上述引物扩增到的片段大小为241bp，具体核苷酸序列见SEQ ID NO.4。
[0043] SEQ ID NO.2：5'‑CGGGGTATCATCAATCCTG‑3'
[0044] SEQ ID NO.3：5'‑GTGTTGGTAGAGAACTGGGT‑3'
[0045] SEQ ID NO.4：
[0046] CGGGGTATCATCAATCCTGGGGGCAATCAATTTTATTACAACAATTATTAATATAAAACCCGCATCCACAACACAATACCAAACACCCCTGTTCGTCTGATCTGTTCTGATCACTGCTGTACTCCTGCTTCTTTCTCTCCCAGTCCTAGCCGCTGGAATTACCATACTTCTCACAGACCGAAATCTAAACACCACCTTTTTCGACCCTGCAGGGGGAGGAGACCCAGTTCTCTACCAACAC
[0047] 实施例3：利用PCR鉴定林蛙油的方法
[0048] (1)蛙油DNA的提取
[0049] 使用TIANamp Genomic DNAKit血液/细胞/组织/基因组DNA提取试剂盒提取林蛙油DNA。
[0050] ①取10mg林蛙油打碎处理为悬液，10000rpm离心1min，倒掉上清，加入200μL缓冲液GA，振荡至完全悬浮。加入20μL Proteinase K，混匀。56℃静止3h，每小时颠倒2～3次。
[0051] ②加入200μL缓冲液GB，充分混匀后，70℃放置10min。
[0052] ③加入200μL无水乙醇，振荡15s。
[0053] ④将所得液体加入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中。
[0054] ⑤向吸附柱中加入200μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中。
[0055] ⑥向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，并重复操作一次。
[0056] ⑦吸附柱及收集管12000rpm离心2min，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，至于室温5min。
[0057] ⑧将吸附柱转移至干净的离心管内，向吸附膜中间悬空滴加100μL缓冲液，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管内。得到DNA。
[0058] 林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油的DNA提取方法都采用如上方法。
[0059] (2)PCR扩增
[0060] 以蛙油DNA为模板，进行PCR扩增。
[0061] PCR扩增的体系为：2×Es Taq Master Mix 10.0μL，上下游引物各1μL，DNA模板4μL，ddH2O 4μL。
[0062] 其中，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0063] PCR扩增的程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃2min。
[0064] PCR结束后取10μL产物，加入2μL 6×loading Buffer，充分混匀在1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0065] 本发明选用林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油为样品安按照上述方法进行鉴定，鉴定结果见图2。如图2所示仅林蛙油在240bp处具有明亮的单一条带，青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油在240bp处均无条带显示。证明该PCR鉴定方法能够从林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油等不同种类蛙油中鉴别出林蛙油。
[0066] 实施例4：利用PCR鉴定林蛙的方法
[0067] 本实施例所述方法为取待测蛙种的蛙油，对蛙油DNA进行提取，然后再进行PCR扩增，具体方法如下：
[0068] (1)蛙油DNA提取
[0069] 使用TIANamp Genomic DNAKit血液/细胞/组织/基因组DNA提取试剂盒提取林蛙油DNA。
[0070] ①取10mg林蛙油打碎处理为悬液，10000rpm离心1min，倒掉上清，加入200μL缓冲液GA，振荡至完全悬浮。加入20μL Proteinase K，混匀。56℃静止3h，每小时颠倒2～3次。
[0071] ②加入200μL缓冲液GB，充分混匀后，70℃放置10min。
[0072] ③加入200μL无水乙醇，振荡15s。
[0073] ④将所得液体加入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中。
[0074] ⑤向吸附柱中加入200μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中。
[0075] ⑥向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，并重复操作一次。
[0076] ⑦吸附柱及收集管12000rpm离心2min，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，至于室温5min。
[0077] ⑧将吸附柱转移至干净的离心管内，向吸附膜中间悬空滴加100μL缓冲液，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管内。得到DNA。
[0078] 林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油的DNA提取方法都采用如上方法。
[0079] (2)PCR扩增
[0080] 以蛙油DNA为模板，进行PCR扩增。
[0081] PCR扩增的体系为：2×Es Taq Master Mix 10.0μL，上下游引物各1μL，DNA模板4μL，ddH2O 4μL。
[0082] 其中，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0083] PCR扩增的程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃2min。
[0084] PCR结束后取10μL产物，加入2μL 6×loading Buffer，充分混匀在1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0085] 本发明选用的蛙种对应的蛙油均按照上述方法进行鉴定。若蛙油在240bp处具有明亮的单一条带，则证明该蛙油取自林蛙，从而达到将林蛙与其他蛙种区分开的目的。
[0086] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
