[0001] 本发明涉及农业基因工程技术领域，具体涉及一种检测羊皮下脂肪的circRNA、产品及其应用。

[0002] circRNA是最早发现于植物病毒以及流感病毒中的一类闭合环状RNA分子，经特殊剪切生成。circRNA不具5'帽子和3'多聚腺苷酸结构，相较线性RNA来说，由于核糖核酸酶不能降解circRNA，因此circRNA更加稳定。内源性竞争circRNA还可以影响miRNA活性，进而调控基因表达，推测circRNA可能通过以上原理对成脂分化进行调节。研究发现在前体脂肪细胞体外分化体系试验中有31种circRNA会随脂肪分化过程显著升高，相关性分析表明这些circRNA分子的表达可能与对应的线性RNA表达状态相关。有研究在对莱芜猪与大白猪皮下脂肪组织进行探索时发现，circRNA_26852和circRNA_11897可以靶向那些富集到与脂代谢以及疾病相关通路中的基因。CircACC1通过促进LO2肝细胞AMPK全酶组装、活性和稳定性，使脂肪酸β氧化得到促进。因此，推测circRNA有可能参与了脂质代谢的调节，并可以为脂代谢相关性疾病提供潜在靶点。

[0003] 有关于羊皮下脂肪脂肪相关的研究目前较少，为了进一步发现新的与羊皮下脂肪相关的circRNA，发明人基于高通量测序技术，选取脂肪沉淀存在较大差异、具有代表性的多浪羊(D)与小尾寒羊(X)为研究对象，前者属于肉脂兼用型绵羊，脂臀较大，后者属于短瘦尾型绵羊，皮下脂肪较少，筛选鉴定出与脂代谢以及成脂分化关键候选基因，探究脂肪沉积相关的分子机制。

[0039] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

[0040] 实施例1样品的采集剂RNA提取

[0041] 1.1样品的采集

[0042] 本试验以脂肪沉积存在差异的多浪羊(D)与小尾寒羊(X)为对象进行研究。选取的羊只均为成年雌性，并且个体体况良好、健壮无病，体重相近(约50kg)，每组有三个生物学重复。

[0043] 1.2样本RNA的提取和质量检测

[0044] 取出各样品中等量的脂肪组织用作提取总RNA，确保整个流程在无菌环境下进行，步骤如下：

[0045] (1)分别在加有液氮的研钵里研磨脂肪组织；

[0046] (2)将研磨好的组织放入加有Trizol试剂的离心管中静置；

[0047] (3)加入氯仿混匀并在室温下静置10分钟；

[0048] (4)放入离心机中，在4℃条件下，转速12000，离心15分钟；

[0049] (5)将最上层无色液体放入RNase free管中，用等量异丙醇来沉淀RNA，室温下混合均匀静置10分钟；

[0050] (6)再次在温度为4℃、转速为12000条件下离心15分钟；

[0051] (7)将上清液去除，在沉淀中加入乙醇(75％)充分混匀后，再一次在上述条件下离心；

[0052] (8)去除上清液，继续加乙醇清洗RNA2‑3次；

[0053] (9)弃乙醇，沉淀干燥处理5‑10分钟；

[0054] (10)最后沉淀物用RNA无酶水处理。

[0055] 为保证总RNA纯度及完整性，将其进行质量检测：

[0056] 建库测序的要求是RNA总量不少于2ug，对longRNA(mRNA、lncRNA、circRNA)的文库构建采用TruSeqTM Stranded Total RNA Kit试剂盒，RNA总量为2μg，浓度在100ng/μL以上，OD260/280范围是1.8‑2.2。

[0057] 分别对多浪羊和小尾寒羊的6个皮下脂肪组织提取总RNA并进行质量检测，结果可见28S条带亮度相对于18S来说均显著较高；各样本RNA浓度高于200ng/μl；RIN值均大于8，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.0，说明RNA没有被碳水化合物和蛋白质等杂质污染，且完整性较好，可在后续试验中继续应用。

[0058] 实施例2测序及数据分析

[0059] 使用Illumina NovaSeq 6000测序平台测序。circRNA呈封闭的环形，由分别处在上游与下游的外显子剪接受体与供体位点反向连接而成，属于非编码RNA分子，RNA外切酶对其没有影响，更不易降解，所以更加稳定。线性RNA片段可以通过线性比对软件进行比对，但是处于环状RNA的反式剪切位置的Reads无法直接比对上基因组。基于Back splice junction(BSJ)reads，利用相关软件(CIRI2+find_circ取并集)进行circRNA预测，并与数据库circBase(动物)进行比较。

[0060] 根据circRNA在基因组上的起始点和终止点进行分类。第一类终止点和起始点均位于基因的外显子区域为exon circRNA。第二类起始点或终止点某一端位于基因的内含子区域为intron circRNA。第三类起始点或终止点某一端位于基因间区或当起始点和终止点均位于基因外显子区域，但两个外显子不在同一个基因上时，circRNA分类为inergenic circRNA。

[0061] 样本表达量差异分析。使用RPM(Reads per millon reads)，作为定量指标，计算公式为：

[0062] RPM＝Total exon reads/Mapped reads(Millions)

[0063] 其中，Total exon reads表示某个样本Mapping到特定基因外显子上的全部reads；Mapped reads代表某个样本的全部reads总量。在多浪羊与小尾寒羊皮下脂肪组织中共得到18947个circRNA，对这些数据进行差异表达分析，(以|Fold Change|≥2.0，
Pvalue<0.05为标准进行筛选)，在两品种羊皮下脂肪组织中共存在141个差异表达的
circRNAs，其中有61个差异基因上调表达，80个下调表达。其中差异表达显著的
circRNA——NC_040256.1_12467238_12540333是本申请首次发现，作为我们后续的候选分子中。

[0064] 为了了解差异表达基因以及基因产物的功能，使用GO注释对差异表达基因进行三方面的注释分析，包括生物过程、细胞成分和分子功能。对差异circRNA的来源基因进行分析，发现共富集到379个条目，以Pvalue<0.01为条件筛选到了99个条目。如图1，差异表达circRNA来源基因在分子功能，主要富集在翻译抑制活动(translation repressor activity)、瘦素受体结合(leptin receptor binding)、三磷酸酶活性(triphosphatase activity)等条目；在细胞组分，主要富集在核糖核蛋白颗粒(ribonucleoprotein 
granule)、纤维状胶原三聚体(fibrillar collagen trimer)、核苷酸激活的蛋白激酶复合物(nucleotide‑activated protein kinase complex)、细胞质核糖核蛋白颗粒
(cytoplasmic ribonucleoprotein granule)；在生物过程，蛋白质激活级联(protein 
activation cascade)、质膜结合细胞投射组件(plasma membrane bounded cell 
projection assembly)、囊泡细胞骨架运输(vesicle cytoskeletal trafficking)和TOR信号的调节(regulation of TOR signaling)等过程。通过GO功能研究发现，差异表达
circRNA的来源基因通过调控瘦素受体结合酶、三磷酸酶等与脂肪沉积相关的酶活性调节参与到脂肪发育中来。

[0065] 在多浪羊和小尾寒羊的皮下脂肪组织中，circRNA的来源基因共富集到110条通路中(图2，以Pvalue<0.05为条件进行筛选，共得到了3个显著富集通路，蛋白质消化吸收(Protein digestion and absorption)、胰高血糖素信号通路(Glucagon signaling 
pathway)和调节脂肪细胞中的脂肪分解(Regulation of lipolysis in adipocytes)。通过KEGG通路分析表明，差异表达circRNA来源基因在多浪羊与小尾寒羊皮下脂肪组织中参与到脂肪代谢相关的通路中，富集到通路中的差异基因可能对于两品种羊皮下脂肪沉积具有重要的调控作用。

[0066] 实施例3实时荧光定量PCR检测验证

[0067] 本实验分别收集20只多浪羊和小尾寒羊，在两个组之间对差异表达的circRNA进行PCR检测，每个基因3个重复，验证NC_040256.1_12467238_12540333基因差异表达情况。

[0068] 主要方法如下：

[0069] 用circRNA cDNA Synthesis Kit(GenePool，Cat#GPQ1805)进行反转录，反应体系为：2×FastSYBR Mixture，10μl；下游引物(10uM)与上游引物(10uM)各0.4μl；模板，2μl；灭菌蒸馏水至20μl。引物信息见表。

[0070] 表1 PCR反应结果

[0071]

[0072] 反应结束后导出数据，用2‑ΔΔCt法计算样本相对表达情况，t‑检验统计分析相对表达情况，数据显示为平均数±标准差(Mean±SD)，P＜0.05为显著。PCR数据分析及结果，利‑△△Ct用2 法计算CIRCRNA基因在各个样本间的相对表达量，数据表示为平均数±标准差
(Mean±SD)，P<0.05表示该基因在两组间差异显著。结果表明，NC_040256.1_12467238_
12540333基因在小尾寒羊羊皮下脂肪组织中显著上调表达。

[0073] 本申请通过功能注释及富集分析筛选得到与脂肪沉积紧密相关的circRNA基因，荧光定量PCR实验结果进一步验证了该结论。