技术领域
[0001] 本发明涉及应用微生物技术领域，具体涉及一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌及其应用。
相关背景技术
[0002] 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，其可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香化合物，同时将分子氧还原成水。漆酶能催化大量的化学反应，包括降解聚合物，氧化偶联酚类化合物，使多聚化合物和环裂化合物功能化，被广泛应用于各种生物技术领域，包括污染物降解、染料解毒、纸浆生物预处理、食品、纺织印染等。
[0003] 漆酶在自然界中分布广泛，其来源包括植物、真菌、原核生物以及节肢动物等。目前工业所用漆酶大多来自真菌，如担子菌门栓菌属、侧耳属、子囊菌门的曲霉属、青霉菌属等。但是由于真菌存在生长周期长、对环境适应性差、以及易于被孢子污染等问题，使得真菌漆酶的产量及应用范围受到了极大限制。与真菌漆酶相比，细菌漆酶的稳定性更强，能够耐受碱性、高温、高盐等条件，且发酵生产周期短，具有更广阔的推广前景。
[0004] 因此，筛选优良的漆酶生产细菌菌株，并研究其生物学特性及酶学性质，对拓展漆酶的应用范围具有重要意义。
具体实施方式
[0031] 一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌，所述菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏日期为2021.07.13，保藏编号为CGMCC No. 22881，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0032] 所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)FM‑78筛选自南京紫金山的腐木、土壤。
[0033] 所述一株产芽孢漆酶的芽孢杆菌(Bacillus cereus)FM‑78的筛选方法包括以下步骤：
[0034] 1)将腐木、土壤样品1～5g，加入6～30mL LB培养基，30～37℃培养20～30h，富集菌种；
[0035] 2)将所得菌种原液稀释10倍，放置于75‑80℃水浴锅加热15‑20min；
[0036] 3)将所有样品混合经梯度稀释10‑4～10‑5，涂布于含有0.1～0.3mmol/LCuSO4的LB培养基平板，30～37℃培养；
[0037] 4)待菌落长出后，在菌落及其周围滴加1～3mmol/L的丁香醛连氮，若在滴定区域显现浅粉色，表示菌株可产漆酶，挑选目的菌落进行划线纯化3～4次，至菌落性状稳定转接至LB 试管斜面培养基中，筛选得到一株菌FM‑78，其菌落呈白色，不透明，表面粗糙，经革兰氏染色确认为革兰氏阳性菌。
[0038] 对所述菌株FM‑78进行16S rRNA鉴定，鉴定为蜡样芽孢杆菌。并于NCBI中进行BLAST 比对构建系统发育树。
[0039] 制备芽孢漆酶方法包括以下步骤：
[0040] 将菌株划线接种于含有0.1～0.3mmol/LCuSO4的LB固体产孢培养基，32～37℃倒置培养 3～5d；
[0041] 用无菌去离子水将芽孢冲洗下来，加入终浓度为0.1～0.3mg/mL的溶菌酶，37～40℃水浴 5～10min；
[0042] 依次用含有10mmol/LEDTA的1mol/L NaCl溶液、0.14mol/L NaCl溶液、质量浓度为0.1％的SDS、无菌去离子水分别清洗芽孢；
[0043] 将芽孢于75～80℃水浴热击5～10min，然后用无菌去离子清洗3～5次，用去离子水悬浮芽孢，制成粗酶液，取出一定量芽孢悬液，置于80℃烘箱烘干至恒重，计算出芽孢悬液浓度，剩余芽孢悬液置于4℃冰箱备用。
[0044] 利用ABTS法测定其活性，反应体系为3mL，含有1mmol/L ABTS,100μL芽孢悬液，以及柠檬酸‑磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH3.0),，30℃反应3min后在420nm处测定吸光度。
[0045] 具体实施方式一：Bacillus cereus FM‑78的分离筛选与鉴定
[0046] 本实施例从采集自南京紫金山腐木、土壤样品中富集芽孢杆菌，具体如下：
[0047] (1)分别将1g腐木和土壤样品，加入6mL LB培养基，37℃培养20h，富集菌种；
[0048] (2)将步骤(1)所得菌种原液稀释10倍，放置于75℃水浴锅加热20min；
[0049] (3)将步骤(2)中所有样品混合经梯度稀释10‑4，涂布于含有0.1mmol/LCuSO4的LB培养基平板，37℃培养；
[0050] LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH 7.0～7.2，按照需要加入0.1mmol/L CuSO4；
[0051] (4)待菌落长出后，在菌落及其周围滴加1mmol/L的丁香醛连氮，若在滴定区域显现浅粉色，表示菌株可产漆酶，挑选目的菌落进行划线纯化3～4次，至菌落性状稳定转接至LB试管斜面培养基中，筛选得到一株菌FM‑78，其菌落呈白色，不透明，表面粗糙，经革兰氏染色确认为革兰氏阳性菌；
[0052] (5)提取该菌的基因组DNA并以此为模板采用通用27F，1514R引物扩增16S rDNA片段，将该菌的16S rDNA序列上传到NCBI数据库进行序列比对，然后用CLUSTALW2软件进行同源性分析，再用MEGA5软件构建该菌的系统发育树，参见图1。
[0053] 具体实施方式二：pH和温度对芽孢漆酶活性的影响
[0054] 将菌株划线接种于含有0.1mmol/LCuSO4的LB固体产孢培养基，37℃倒置培养3d；用无菌去离子水将芽孢冲洗下来，加入终浓度为0.1mg/mL的溶菌酶，37℃水浴10min；依次用含有10mmol/LEDTA的1mol/L NaCl溶液、0.14mol/L NaCl溶液、质量浓度为0.1％的SDS、无菌去离子水分别清洗芽孢；将芽孢于80℃水浴热击10min，然后用无菌去离子清洗3次，用去离子水悬浮芽孢，制成粗酶液。利用ABTS法测定其活性，反应体系为3mL，含有1mmol/L ABTS，100μL芽孢悬液，以及柠檬酸‑磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH3.0)，30℃反应3min后在
420nm处测定吸光度。测定2.2～7.0pH以及20～100℃范围内漆酶对ABTS的催化活性的影响。FM‑78芽孢漆酶的最适pH为3.0，最适反应温度为60℃，在20～100℃内均具有活性。
[0055] 具体实施方式三：染料褪色试验
[0056] 染料脱色实验反应体系为3mL，体系中加入pH 7.0柠檬酸‑磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/L)，终浓度分别为40mg/L、100mg/L和5mg/L的活性黑、RB亮蓝、结晶紫，以及100μL的酶液， 150rpm，40℃分别振摇2h和6h。定时取样2mL，8000rpm离心5min，测定各染料最大吸收波长下的吸光值并计算染料脱色率。同时添加0.1mmol/L和0.01mmol/L的乙酰丁香酮 (ACE)和ABTS，测定这两种介体对染料脱色率的影响。结果表明，在无介体时，FM‑78 漆酶可对3种不同类型的染料脱色，但脱色效率较低。介体可不同程度的提高酶对这3种染料的脱色率，其中ABTS的辅助脱色效果较佳。
