[0001] 本发明一种竹黄菌漆酶，特别是一种竹黄菌漆酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列、漆酶的酶学性质以及该漆酶的应用，属于工业微生物领域。

[0002] 漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶蛋白家族。漆酶的分布非常广，在植物，细菌和一些昆虫中都有发现，尤其在高级真菌里分布最多。在真菌中，漆酶的主要生产者有半知菌、担子菌、云芝菌、毛壳菌、侧耳菌、木霉菌等。

[0003] 漆酶是一种多铜酶，可以催化氧化一系列底物，例如邻位和对位二元酚、多酚、二元胺、芳香胺、酚醛、苯硫酚、酚酸和其他的衍生物等，利用一电子氧化机制把分子氧还原成水。如果存在合适的氧化还原介质，漆酶可以氧化的底物范围还会有很大的增加。由于广泛的底物特异性，漆酶可以用于药物分析，酒的澄清，纸浆漂白、合成染料脱色、污水的生物治理、生物传感器以及化学合成，还有报道指出漆酶还可以抑制HIV-1病毒的逆转录酶。同时漆酶的催化特性也得到了很多领域的关注，主要涉及生物燃料电池的氧阴极、免疫标签以及生物催化的有机合成等方面。漆酶已成为一种重要的、与工业相关的酶，越来越受到人们的重视。

[0004] 竹黄(Shiraia bambusicola p. Henn.)又名天竹花、竹三七、赤团子等，是我国一种传统的药用真菌，隶属于子囊菌亚门，核菌纲，球壳目，肉座菌科，竹黄属。特异寄生于某些竹子的嫩枝上，其子实体称为竹黄。竹黄是一种民间药材，常用其泡酒，治疗坐骨神经痛、风湿性关节炎、跌打损伤、虚寒胃痛、气管炎和小儿惊风等症。前期我们发明了“一种竹黄菌发酵生产漆酶的方法（ZL 201010501212.X）”，本发明进一步阐明了该漆酶的性质及用途。

[0038] 下面用实施例对本发明做进一步说明。

[0039] 以下实施例中所使用的实验材料，如无特殊说明，均为可购买到的生化试剂。其中真菌DNA与RNA提取试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，PCR所用试剂及其试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。

[0040] 本发明中所使用的漆酶生产菌——竹黄菌株Shiraia sp. SUPER-H168已在专利ZL 200710132510.4中公开，漆酶的发酵培养方法在专利ZL 201010501212.X中公开。

[0041] 本发明中所用漆酶酶活的测定方法是用分光光度计检测漆酶与底物反应后吸光度，计算漆酶活性。以上所说的底物为DMP。酶活定义为每分钟氧化1μmol底物为产物所需的酶量为一个酶活力单位。酶活测定以DMP为底物，反应温度为50℃，反应体系为3mL，包括0.5mL 10mmol/L的DMP、2.4mL 磷酸-柠檬酸缓冲溶液（20mmol/L，pH3.0）和0.1mL酶液。

[0042] 实施例1本实施例为本发明所述漆酶的分离纯化，其纯化步骤为：
1、竹黄菌产漆酶的发酵液10000g、4℃离心20分钟收集上清得到粗酶液。

[0043] 2、将步骤1得到的粗酶液进行冷冻干燥浓缩，将干燥得到的酶粉用少量的缓冲液A(20mM NaAc-HAc，pH 4.5)溶解过阳离子交换柱(HiPrep 16/10 CM FF)。阳离子柱首先用20mL的缓冲液B(1M NaCl溶解在20mM NaAc-HAc，pH 4.5)预洗，洗掉柱子里带有的杂蛋白，再用40mL的缓冲液A平衡柱子，然后上样用缓冲液溶解的粗酶粉，最后用40mL的缓冲液A洗脱漆酶蛋白，将未结合到离子柱上的杂质洗脱掉，用4个梯度的缓冲液洗脱(四个梯度的NaCl浓度分别为0.05、0.07、0.15及0.30M) 流速为2mL/min，总共洗脱240mL，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来，收集有酶活的洗脱液用超滤管(30-kDa)进行浓缩。这一步的纯化倍数为2.12，酶的回收率为24.16%，去除了大部分的杂质。

[0044] 3、将第二步浓缩的酶液过凝胶柱G200。首先，用含有0.2M NaCl 的10 mM Tris-HCl 缓冲液(pH 7.0)平衡凝胶柱同时除掉柱子中带有的杂蛋白，上样浓缩的酶液，用相同的缓冲液0.5mL/min洗脱酶液，最后收集有酶活的洗脱液。这一步纯化倍数为2.14，酶的回收率为12.98%，得到了纯漆酶。

[0045] 实施例2本实施例为利用质谱测定实施例1中得到的本发明所述纯漆酶的分子量大小。将实施例1中得到的纯酶用超滤管(30kDa)浓缩至终浓度为1-2mg/mL。质谱测定基质为：戒子酸(SA)饱和溶解在TA30(30�N，0.1%TFA)中。取上述浓缩纯酶液和SA基质各1μL混合，取
1μL混合液于不锈钢靶中，干燥后在线性正离子模式LP30-210kDa下上MALDI-TOF(Bruker 公司)。得到漆酶蛋白的质谱图，确定漆酶的分子量为70.78 kDa。

[0046] 实施例3本实施例为本发明所述漆酶的最适温度及温度稳定性。如图5、图6所示，以DMP为底物，将底物与pH为3.5的磷酸缓冲液在20-70℃不同的温度条件下水浴10分钟测定漆酶的酶活，结果发现在50℃条件下测得的漆酶酶活最高，可以确定酶的最适温度为50℃。将本发明所述的漆酶置于40、50、60与70℃下处理3小时，发现40和50℃条件下酶活基本没有损失，当温度达到60℃时，3小时后剩余酶活仅为开始时的40%，温度高于70℃后，酶在短时间内就完全失活。

[0047] 实施例4本实施例为本发明所述漆酶的最适pH值及pH稳定性。如图7、图8所示，分别将DMP、愈创木酚、丁香醛连氮和ABTS置于pH2.5-9.0的磷酸缓冲液中50℃水浴10分钟，发现漆酶在不同的底物条件下其最适pH值也不同，以DMP、愈创木酚、丁香醛连氮和ABTS为底物其最适pH值分别为4-5、5.5、6和3-4。以DMP为底物研究pH对本发明所述漆酶稳定性的影响，将漆酶分别置于pH值为3-9的缓冲液中处理96小时测定剩余酶活发现pH值在6-7时酶活比较稳定，pH值低于5或高于8时剩余酶活不足起始的50%。

[0048] 实施例5本实施例为不同金属离子与抑制剂对本发明所述漆酶酶活的影响。将本发明所述的漆
2+
酶置于浓度为10mM的不同金属离子与抑制剂溶液中处理10分钟测定其剩余酶活发现Fe ，+ 3+
Ag 和Fe 离子作用10分钟后，酶活损失较大，剩余酶活分别为0%,8.13%和67.50%。被酶的抑制剂SDS和NaN3作用10分钟的剩余酶活分别为10.22%和7.86%，其它抑制剂NaF、DTT、L-cys、EDTA及EGTA相对来说抑制作用较弱。下表1和表2分别为金属离子与抑制剂对酶活性的影响。

[0049] 表1金属离子对酶活性的影响表2抑制剂对酶活性的影响
实施例6
本实施例为本发明所述漆酶基因的克隆与表达。

[0050] 1、竹黄菌（Shiraia SP. SUPER-H168）DNA及总RNA的提取，方法如下：(1)竹黄菌（Shiraia SP. SUPER-H168）DNA的提取
将竹黄菌（Shiraia SP. SUPER-H168）菌株在PDA培养基中培养16小时，12000 r/min离心10分钟得到菌体，然后按照北京天恩泽公司的柱式真菌DNA提取方法提取DNA，其步骤如下：
称取0.1-0.5g湿的真菌菌丝、孢子、子实体或0.1-3mL液体培养物离心得到的沉淀，转移到塑料研钵中，液氮研磨成粉后转移到一个干净的1.5mL塑料离心管中。

[0051] 在离心管中加入1mL 65℃预热的溶液A并用移液枪头充分吹打混匀（如果溶液A有沉淀，需先在65℃加热溶解后摇匀再使用）。

[0052] 65℃保温5-30分钟，其间最好吹打混匀2-3次。

[0053] 12000-15000g室温离心3分钟。

[0054] 将不超过0.75mL的上清转移到新离心管中。有时候上清液中还会有少量细小悬浮物，但对后续操作没有影响，不必进行特殊处理。

[0055] 在上清液中加入等体积的溶液B，上下颠倒30秒充分混匀，溶液将呈白色混浊状。

[0056] 将其置于冰浴中放置5-10分钟。

[0057] 12000-15000g室温离心3分钟，转移上清到新的1.5mL塑料离心管中。

[0058] 加入0.2mL的氯仿(自备)，震荡器上充分振荡30秒混匀。

[0059] 2000-15000g室温离心3分钟，两相交界面将有白色膜状物，小心转移上清到新1.5-5mL塑料离心管中。注意：由于下一步要加1.5倍体积的溶液C，所以新的离心管的体积要足够大。

[0060] 加入1.5倍体积的溶液C，上下颠倒30秒混匀，然后分多次的将混合液转移到离心吸附柱中。

[0061] 每次转移0.7-0.8mL混合液后，室温放置5-10分钟。

[0062] 12000-15000g室温1分钟，弃穿透液。

[0063] 对需要多次上柱的样品，可以在此将剩余的样品加到离心吸附柱式中，重复第12-14步的操作。

[0064] 将0.7mL通用洗柱液加入离心柱，室温离心1分钟，弃穿透液。

[0065] 在离心吸附柱中加入0.3mL的通用洗柱液，12000-15000g离心半分钟（此步为第二次洗涤）。

[0066] 空甩1分钟去除残留液体。

[0067] 将离心柱放置在一新的1.5mL塑料离心管中，加入30-100uL通用洗脱液。

[0068] 室温放置5分钟后离心1分钟，管底即为真菌DNA溶液，可立即使用，也可长期保存在-20℃。

[0069] 可以重复上步一次，以洗脱更多的DNA。

[0070] (2)竹黄菌（Shiraia SP. SUPER-H168）总RNA的提取将竹黄菌（Shiraia SP. SUPER-H168）菌株在发酵培养基（土豆200g/L，可溶性淀粉
20g/L，酵母粉10g/L，CuSO4·5H2O 0.6g/L，KH2PO4 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L）中培养64小时，10000g离心10分钟得到菌体，然后按照北京天恩泽公司的一站式真菌mRNA提取试剂盒中的方法提取总RNA，方法如下：
将50mg左右的干菌丝(或100 mg 左右的鲜菌丝、或适当数量的真菌菌落)转移到
1.5mL塑料离心管中。如果是液体真菌培养物，则直接将1-10mL液体真菌在1.5mL塑料离心管中12000-15000g离心1分钟，并弃尽液体培养基（可以分多次离心）。

[0071] 加入0.4mL溶液A并充分吹打混匀。如果A溶液存放时产生沉淀，请置于65℃融化，用前充分摇晃均匀。

[0072] 加入0.4mL溶液B，剧烈振荡30秒。

[0073] 65℃保温5分钟。

[0074] 室温12000-15000g离心3-5分钟，转移上清到一干净的1.5mL塑料离心管中.再加入0.1mL溶液B和0.1mL自备氯仿，振荡混匀30秒。

[0075] 室温12000-15000g离心3-5分钟，转移上清到一干净的1.5mL塑料离心管中。

[0076] 加入两倍体积（约0.8-1mL）的溶液C，充分混匀。

[0077] 室温12000-15000g离心离心3-10分钟，RNA将在管底形成沉淀，小心弃上清。

[0078] 加自备的75%乙醇，振荡器上振荡混均30秒。

[0079] 室温12000-15000g离心1分钟。

[0080] 小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。

[0081] 重复75%乙醇洗涤步骤一次。

[0082] 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液（约50uL）。

[0083] 短暂放1-2分钟后加入50uL RNA-free水使RNA沉淀溶解，可以立即用于mRNA纯化或存放于-80℃长期保存。

[0084] 2、漆酶基因中间片段的克隆，方法如下：(1)引物设计与引物合成
将竹黄菌（Shiraia SP. SUPER-H168）发酵产的漆酶进行分离纯化，并采用常规方法测定酶蛋白的N序列，根据N端序列设计PCR引物1。从NCBI数据库中比对已知真菌漆酶的蛋白序列，找出其保守序列来设计PCR引物2。其引物序列为：
引物1：
5’ -ACIGGIAAYGGIAAYGGICC -3’
引物2：
5’-TGIMRIKCIATRTGRCARTG- 3’
(2)PCR扩增
用以上合成的两条引物，以竹黄菌（Shiraia SP. SUPER-H168）的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

[0085] 本步骤中扩增体系为：Taq (5U/μL) 0.5μL
10×PCR Buffer 5μL
MgCl2 (25mM) 5μL
dNTP Mixture 8μL
模板DNA 2.5ng
引物1 (20μM) 1μL
引物2 (20μM) 1μL
dH2O 补足到 50μL
扩增程序为：
94℃，3min
94℃, 30sec; 55℃, 30sec; 72℃ 1min 反应30个循环
72℃，10min
所得产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，将得到的目的条带采用常规方法测序，所得序列在NCBI中进行比对分析，验证克隆片段是否为漆酶基因。

[0086] 3、漆酶基因的3’RACE，方法如下：(1)反转录
将实施例1中提取的RNA进行反转录，反转录采用TaKaRa的试剂盒，其反应体系如下：
RNA 3μL
3’RACE Adaptor (5μM) 1μL
5×M-MLV Bufffer 2μL
dNTP Mixture 1μL
RNase Inhibitor (40U/μl) 0.25μL
Reverse Transcriptase M-MLV 0.25μL
RNase Free dH2O 2.5μL
总体积 10μL
反应条件为：
70℃，10min；42℃，60min；70℃，15min
(2) 3’端引物的设计与克隆
根据实施例2中得到的中间片段序列，设计并合成基因特异性上游引物S1，以TaKaRa提供的3’RACE Outer Primer为下游引物，其序列分别为：
S1：5’-GTCAATGGCAGTTCTCAAATCGTC-3’
3’RACE Outer Primer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’
以前步骤(1)反转录得到的cDNA为模板，利用上游引物S1和下游引物3’RACE Outer Primer进行PCR扩增。

[0087] 本步骤的扩增体系为：cDNA 5μL
1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 5μL
基因特异性引物S1 (10μM) 2μL
3’RACE Outer Primer (10μM) 2μL
10×LA PCR Buffer Ⅱ 4μL
MgCl2 (25mM) 3μL
TaKaRa LA Taq (5U/μl) 0.25μL
dH2O 补足至 50μL
扩增反应条件为：
94℃，3min
94℃, 30sec; 55℃, 30sec; 72℃ 1min 反应30个循环
72℃，10min
所得产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，将得到的目的条带采用常规方法测序，所得序列在NCBI中进行比对分析，验证克隆片段是否为漆酶基因。

[0088] 4．漆酶基因的5’RACE，方法如下：(1)预处理与反转录
预处理与反转录采用TaKaRa的试剂盒，其操作步骤如下：
A、去磷酸化处理
使用Alkaline Phosphatase对Total RNA中裸露的5’磷酸基团进行去磷酸反应。

[0089] ① 按下列组份配制去磷酸反应液Total RNA（1μg/μL） 2μL
RNase Inhibitor（40U/μL） 1μL
10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL
Alkaline Phosphatase（16U/μL） 0.6μL
RNase Free dH2O up to 50μL
② 50℃反应1小时。

[0090] ③ 向上述反应液中加入20μL的3M CH3COONa（pH5.2），130μL的RNase Free dH2O后，充分混匀。

[0091] ④ 加入200μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀后13,000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。

[0092] ⑤ 加入200μL的氯仿，充分混匀后13,000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。

[0093] ⑥ 加入2μL的NA Carrier后均匀混合。

[0094] ⑦ 加入200μL的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟。

[0095] ⑧ 13,000g 4℃离心20分钟，弃上清。

[0096] ⑨ 加入500μL的70%冷乙醇（RNase Free dH2O配制）漂洗，13,000g 4℃离心5分钟，弃上清后干燥。

[0097] ⑩ 加入7μL的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。

[0098] B、“去帽子”反应使用Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）去掉mRNA的5’帽子结构，保留一个磷酸基团。

[0099] ① 按下列组份配制“去帽子”反应液CIAP-treated RNA 7μL
RNase Inhibitor（40U/μL） 1μL
10×TAP Reaction Buffer 1μL
Tobacco Acid Pyrophosphatase（0.5U/μL） 1μl
总体积 10μL
② 37℃反应1小时。

[0100] ③ 此反应液为CIAP/TAP-treated RNA。取5μL用于5’RACE Adaptor连接反应，剩余的5μL保存于-80℃。

[0101] C、5’RACE Adaptor的连接① 首先配制下列溶液
CIAP/TAP-treated RNA 5μL
5’RACE Adaptor（15μM） 1μL
RNase Free dH2O 4μL
② 65℃保温5分钟后冰上放置2分钟，然后加入下列试剂
RNase Inhibitor（40U/μL） 1μL
5×RNA Ligation Buffer 8μL
40% PEG#6000 20μL
T4 RNA Ligase（40U/μL） 1μL
③ 16℃反应1小时。

[0102] ④ 向上述反应液中加入20μL的3M CH3COONa（pH5.2），140μL的RNase Free dH2O后，充分混匀。

[0103] ⑤ 加入200μL的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀后13,000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。

[0104] ⑥ 加入200μL的氯仿，充分混匀后13,000g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。

[0105] ⑦ 加入2μL的RNA 沉淀剂后均匀混合。

[0106] ⑧ 加入200μl的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟。

[0107] ⑨ 13,000g 4℃离心20分钟，弃上清。加入500μl的70%冷乙醇（RNase Free dH2O配制）漂洗，13,000g 4℃离心5分钟，弃上清后干燥。

[0108] ⑩ 加入6μl的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到Ligated RNA。

[0109] D、反转录反应① 按下列组份配制反转录反应液
Ligated RNA 6μL
Random 9 mers（50μM） 0.5μL
5×M-MLV Buffer 2μL
dNTP（10mM each） 1μL
RNase Inhibitor（40U/μL） 0.25μL
Reverse Transcriptase M-MLV（200U/μL） 0.25μL
总体积 10μL
② 反转录反应条件如下：
30℃，10min；42℃，1小时；70℃，15min
③ 反应结束后可以进行下一步实验，或将反应液保存于-20℃。

[0110] (2) 5’端引物的设计与克隆根据上述实施例2中得到的中间片段序列，设计并合成基因特异性下游引物S2，以TaKaRa提供的5’RACE Outer Primer为上游引物，其序列分别为：
S2：5’-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3’
5’RACE Outer Primer：5’-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3’
以前步骤(1)反转录得到的cDNA为模板，利用上游引物S2和下游引物5’RACE Outer Primer进行PCR扩增。

[0111] 本步骤的扩增体系为：上述步骤(2)的反转录反应液 2μL
1×cDNA Dilution Buffer II 8μL
10×LA PCR Buffer II 4μL
MgCl2（25mM） 3μL
TaKaRa LA Taq（5U/μL） 0.25μL
基因特异性引物S2（10μM） 2μL
5’RACE Outer Primer（10μM） 2μL
dH2O 补足至50μL
② PCR反应条件如下：
94℃，3min
94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，1min反应20个循环
72℃，10min
所得产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，最小的条带为目的条带，将得到的目的条带采用常规方法测序，所得序列在NCBI中进行比对分析，验证克隆片段是否为漆酶基因。

[0112] 实施例7本实施例为对实施例5中获得的漆酶核苷酸序列和氨基酸序列进行详细的分析。本发明所述漆酶基因总共有1998bp的核苷酸组成，其中有1848bp的阅读框，编码了616个氨基酸，其中有21个氨基酸是信号肽序列(序列SEQ ID NO: 2中加粗序列)。通过与其它已知漆酶基因进行比对，本发明所述漆酶基因中在靠近N端存在有三个内含子，长度分别为
50bp、49bp和51bp(序列SEQ ID NO: 1中斜体加粗序列)。利用蛋白序列的等电点与分子量预测分析工具预测本发明所述漆酶分子量大约为67kDa，等电点大约是7.63。利用氨基酸序列糖基化位点分析软件发现本发明所述漆酶中有大约6个糖基化位点(序列SEQ ID NO: 2中加下划线位置)。在保守结构数据库中队本发明所述漆酶氨基酸序列进行分析，发现本发明所述漆酶与其它漆酶一样都存在有典型的多铜氧化酶保守结构域，同时发现序列中还有多铜氧化酶信号序列为：GAWVMHCHIAFHVGMGLSVQF(序列SEQ ID NO: 2中阴影序列)。本发明所述漆酶基因与Phoma sp. UHH 5-1-03（NCBI accession ID:EU267174.1）的亲缘较近，相似度为75%。

[0113] 实施例8本实施例为漆酶染料降解中的应用，方法如下：
(1)合成染料的脱色率
使用Mapada TM UV-1600可见光分光光度计，通过记录一定时间内染料在最大吸收波长处的OD值变化，根据公式计算：脱色率（%）=A0-A/A0×100%, 其中，A0为染料的初始吸收OD值，A为染料的终止吸收OD值。

[0114] (2)漆酶对蒽醌、偶氮类染料的脱色作用选取蒽醌类染料AB129（200mg/L），偶氮类染料AR1（20mg/L）、RB5（50mg/L），反应体系为3mL，包括0.5mL酶液（6U/mL，以下研究均相同）、1.0mL合成染料、1.5mL的20mmol/L，pH3.0的磷酸-柠檬酸缓冲液。在常温下反应2h，进行最大吸收波长下的OD值测量，根据公式计算得出脱色率。

[0115] 本发明漆酶对各种染料的脱色能力如表3所示：表3本发明漆酶对各种染料的脱色能力
实施例 9
本实施例为本发明所述漆酶在氨基酸转化方面的应用。本发明所述漆酶可催化邻苯二酚与赖氨酸相结合，形成新的赖氨酸衍生物。其催化反应体系为：2mL 20mM磷酸缓冲液、
1mL 10mM的赖氨酸、1mL 10mM的邻苯二酚、1mL 5U/mL的漆酶。在恒定pH为7，不同的温度条件（20-70℃）下分别反应2小时，利用HPLC检测反应产物发现在温度为50℃条件下氨基酸转化率最高，漆酶催化赖氨酸的最适温度选择50℃。在温度为50℃，不同的pH值（3-8）条件下分别反应2小时，利用HPLC检测反应产物发现pH为6时氨基酸转化率最高，pH6为漆酶催化赖氨酸的最适pH值。在50℃、pH6的条件下漆酶催化赖氨酸与邻苯二酚反应2小时，赖氨酸的转化率高达86%。对催化产物做液质联用测得产物分子量为252。漆酶催化邻苯二酚与赖氨酸的反应方程式为：
。