技术领域
[0001] 本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株绿脓杆菌及其应用。
相关背景技术
[0002] 近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，集约化、高密度养殖规模日益扩大，但由于种投饵造成养殖水体中积累大量的残饵，以及养殖动物的粪便及动植物尸体等原因导致水体氮元素含量严重超标，富营养化加剧，使得养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。
[0003] 研究表明，氨氮是水相环境中氮的主要形态，也是造成水体富营养化的主要污染物，其中以铵态氮最多，铵态氮中的非离子形态对水产动物具有较强的毒性，且随着pH和温度而变化，氨氮过高极易容易造成水产养殖动物死亡。
[0004] 目前，水产养殖生产过程中，人们控制氨氮污染的办法通常是通过换注新水降低氨氮浓度，采用曝气方式使部分氨氮逸出水面，例如采用氯消毒去除氨氮，或使用氧合器等来调节水质。由于上述方法不能使氨氮完全能降低到水质要求标准，例如受水源限制，或是鱼类发生气泡病、细菌性鳃病等，因此对氨氮污染的控制效果并不理想。而近年来，微生物脱氮技术去除的微生物技术开始迅速发展，微生物降解氨氮的效率稳定，二次污染小的优点受到水产养殖及环保产业的高度关注，这就要求能够筛选到具有高效氨氮降解功能的微生物。
具体实施方式
[0012] 实施例1：绿脓杆菌AN5分离筛选及鉴定
[0013] 1、筛选的污泥取自江苏射阳南美白对虾养殖塘。
[0014] 2、培养基：
[0015] 1）富集培养基：葡萄糖5g、硫酸铵2g、氯化钠2g、硫酸亚铁0.4g、磷酸氢二钾1g、pH7.2，硫酸镁0.5g、水1000mL；
[0016] 2）分离培养基：富集培养基基础上加20g的琼脂粉；
[0017] 3）筛选培养基：葡萄糖5g、硫酸铵0.225g、氯化钠1g、磷酸氢二钾0.5g、pH7.2、硫酸镁0.25g、去离子水定容至1000mL，其中氨氮含量为45mg/L，分装于250mL小三角瓶，每瓶100mL，121℃灭菌30min。
[0018] 4）葡萄糖蛋白胨液体培养基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、磷酸氢二钾2g、氯化钠5g，水1000mL，pH7.0，过滤分装，121℃灭菌30min。
[0019] 3、筛选：
[0020] 取南美白对虾养殖塘污泥，加一半水搅匀，经1000r/min离心5min后，取上清接种于富集培养基,于30℃培养,富集7d，且每隔1d向其中加入硫酸铵溶液1ml,以淘汰不能+利用NH4 的微生物。发酵液经梯度稀释后涂布在倒置的分离培养基平板上,于30℃培养，挑取平板上长出的单菌落进行重复分离纯化，直到得到单菌株的纯培养，本次实验共获得
10株单菌落，并分别依次命名为AN1、AN2、AN3至AN10。将纯化得到的菌株接种到筛选培养基中，测试各菌株在30℃、150r/min培养24h时上述10株菌对氨氮的降解情况，其中菌株AN5对氨氮的降解率最高，达71.93%（表1）。
[0021] 表1：10株菌在24h降解氨氮的实验结果
[0022]菌株 初始氨氮(mg/mL) 结束氨氮(mg/mL) 降解率(%)
对照组 45 43.47±2.11 3.40
AN1 45 26.43±4.28 41.27
AN2 45 35.20±3.82 32.89
AN3 45 27.24±5.73 39.47
AN4 45 24.46±2.71 45.64
AN5 45 12.63±3.44 71.93
AN6 45 23.36±1.82 48.09
AN7 45 20.44±2.34 54.58
AN8 45 21.28±1.32 52.71
AN9 45 18.69±2.05 58.47
AN10 45 24.36±1.15 45.87
[0023]
[0024] 4、绿脓杆菌鉴定
[0025] 1）菌落形态特征：将AN5菌株在营养琼脂培养基上培养18-24小时，呈现为灰黄色、不透明、表面湿润、无皱褶、直径约2-3mm菌落，镜检其细胞为短杆状。
[0026] 2）利用试剂盒提取AN5菌株的基因组DNA，利用PCR技术扩增16S rRNA序列，测序后获得长度为1771bp的片段。通过BLAST比对分析，其与公布的多株绿脓杆菌的16S rRNA序列相似度为99%，鉴定证实该菌株为绿脓杆菌，与生化鉴定结果一致。
[0027] 将AN5菌株命名为绿脓杆菌AN5（Pseudomonas aeruginosa AN5），已于2013年3月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013068。
[0028] 实施例2：绿脓杆菌AN5微生物制剂降解水产养殖废水实验
[0029] 将绿脓杆菌AN5活化、扩大培养，经液态发酵，离心收集菌泥，加入淀粉载体，烘干制成100亿/g的菌粉。养殖废水取自青岛田横海参保苗池，经测定其氨氮含量为3.14±0.65mg/L，实验容器为塑料桶，实验水体为10L，实验组按照质量比100ppm添加上述菌粉，对照组不加菌粉，实验组和对照组均设置3个平行，实验期间不间断曝气，各容器曝气量调至一致，实验温度为28℃恒温。每24h测定各实验组及对照组水体中的氨氮含量至
96h（表2）。
[0030] 表2绿脓杆菌AN5对养殖废水中氨氮的降解率
[0031]时间 对照组（mg/L） 试验组（mg/L） 氨氮去除率（%）
24h 3.01±0.45 2.33±0.72 22.59
48h 2.86±0.27 1.87±0.48 34.62
72h 2.92±0.61 1.24±0.63 57.53
96h 2.58±0.29 0.97±0.45 62.40
[0032] 从本实验结果来看，AN5菌粉对水产养殖肥水中的氨氮均有较强的降解作用（p＜0.05），且随着菌粉使用时间的延长其降解铵态氮的能力显著加强（p＜0.05）。，本实验中AN5菌种制成的微生物能降低水产养殖过程中氨氮过高的问题，为养殖户降低养殖风险。
[0033] 实施例3：绿脓杆菌AN5降解生活废水实验
[0034] 将绿脓杆菌AN5活化、扩大培养，经液态发酵，离心收集菌泥，加入淀粉载体，烘干制成100亿/g的菌粉。生活废水取自青岛市李沧区李村水产市场排水沟，静置沉淀后取其上清液，测定其氨氮含量为118.27±6.17mg/L，实验容器为塑料桶，实验水体为10L，实验组按照质量比100ppm添加绿脓杆菌AN5微生物制剂，对照组不加微生物，实验组和对照组均设置3个平行，实验期间不间断曝气，各容器曝气量调至一致，实验温度为28℃恒温。每
