技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种漆酶及其编码基因。
相关背景技术
[0002] 漆酶(EC 1.10.3.2)又名蓝色多铜氧化酶，可以氧化包括酚类物质、多酚类物质、苯胺、木质素、多环芳香烃甚至无机物等一系列物质，以分子氧气为电子受体，生成反应过程中唯一的副产物水。因其底物的广谱性及绿色的催化特性，在环保、造纸、纺织、食品等领域具有非常高的应用价值。
[0003] 漆酶的来源广泛。当前应用最多的是真菌漆酶，但由于真菌漆酶不耐高温，在碱性条件下迅速失活，存在多种抑制剂，严重限制了其工业化应用。真菌漆酶一般为含有糖基的糖蛋白，形成了基因工程改造及异源表达上的障碍。细菌漆酶一般为单体蛋白，且具有耐高温，在碱性条件下稳定，抑制剂少等优点，可以克服真菌漆酶应用的缺点，逐渐成为当前的研究热点。
[0004] 尽管漆酶在多领域具有重要用途，但目前漆酶生产效率低、酶学性质等因素限制了其在实际生产中的应用。要实现漆酶的应用价值，必须寻找优质廉价的酶源。
具体实施方式
[0013] 本发明涉及的菌分类命名Kabatiella bupleuri菌株号TSYW‑49，于2022年07月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.25421。
[0014] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0015] 实施例1
[0016] 漆酶基因的克隆和表达载体的构建
[0017] 以Kabatiella bupleuri TSYW‑49菌株CGMCC No.25421cDNA为模板，用上游引物(IF：5'‑ATGTTGTTCGTTCACTTCGC‑3'SEQ ID NO.3)和下游引物(IR：5'‑GCGAAGTGAACGAACAACAG‑3'SEQ ID NO.4)，PCR扩增得到漆酶编码基因(SEQ ID NO.1)。
[0018] 在保证阅读框正确的前提下将漆酶基因重组至表达载体pET28a(Novagen)中，得到重组载体，再将重组载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中(转化方法为电转化法，也可以用氯化钙法)，以抗生素标记法筛选(本实施例中为卡那霉素抗性)，得到阳性的重组菌DH5α‑pET28a‑A1353。挑取单菌落的重组菌DH5α‑pET28a‑A1353于5mL含30μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃振摇过夜培养，提取重组质粒后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，以抗生素标记法筛选(本实施例中为卡那霉素抗性)阳性的重组高效表达菌BL21‑pET28a‑A1353。
[0019] 实施例2
[0020] 漆酶的表达和纯化
[0021] 挑取单菌落的重组菌BL21‑pET28a‑A1353于5mL含30μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃振摇过夜培养，按1％的体积比，吸取上述培养液于新的LB培养基(含30μg/mL卡那霉素)中培养至OD600达到0.5(约3小时)，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续于25℃分别培养
5，10，15，20小时。
[0022] 取培养时间不同的1mL菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μL，蒸馏水45μL，二巯基乙醇5μL)，悬浮细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，12000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS‑PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达漆酶的重组菌。
[0023] 将细菌离心沉淀，每100mL菌液(即上述25℃培养20小时获得的菌液)加8mL Binding Buffer的比例，加入Binding Buffer，超声破碎后，15000rpm离心30分钟后取上清，加入2mL Ni‑NTA树脂(Invitrogen)，30℃振摇结合30分钟，静置沉淀，弃上清，沉淀用10mL Wash Buffer洗涤2次后，上2mL层析柱，然后用Elution Buffer洗脱目的蛋白，以1mL为单位分管收集，合并酶活最高的几管。洗脱的上清添加甘油，使甘油的终体积浓度为
50％，保存于‑80℃，并进行SDS‑PAGE电泳，检测纯化效果。在48.4kDa处的蛋白质条带即为漆酶。(SEQ ID NO.2)
[0024] 实施例3
[0025] 漆酶的脱色研究
[0026] 将实施例2中得到的漆酶进行染料脱色研究，所用染料为靛蓝和孔雀绿。20mL脱色实验组中包含：20mg/mL染料，0.2U/mL漆酶及0.1mM介体乙酰丁香酮(ACE)，余量为柠檬酸‑磷酸二氢钠缓冲液(pH＝6.0)。同时设立不加漆酶的样品作为对照组。脱色反应在25℃进行，间隔一个小时，取样测定染料在各自最大吸收波长处的吸收值，根据如下公式计算脱色率：
[0027]
[0028] I：脱色率；A0：初始染料吸光值；A1：检测染料吸光值。
[0029] 结果表明实施例2中得到的漆酶对两种不同的染料都有明显的脱色效果。其中对靛蓝的脱色效率更高。脱色2h后，靛蓝的脱色率达到93％，脱色6h后，孔雀绿的脱色率达到74％。
