[0001] 本发明属于生物发酵技术领域，具体地，本发明涉及植物乳植杆菌及其应用。

[0002] 植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)是乳酸菌属的一种厌氧或兼性厌氧菌，菌种为直或弯的杆状，通常为0.9～1.2μm×3.0～8.0μm，单个、成对或成链状，一般缺乏鞭毛，但能够运动。植物乳杆菌是革兰氏阳性菌，不生芽孢。菌落表面直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色。植物乳杆菌属化能异养菌，生长需要营养丰富的培养基，能发酵戊糖或葡萄糖酸盐，终产物中85％以上是乳酸。能在葡萄酸盐中生长，并产CO2。在15℃即可生长，通常最适生长温度为30～35℃。

[0003] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是食品发酵工业中常见的益生菌，并且是GRAS(generally regardedas safe)微生物成员，已经被广泛应用于奶制品、肉制品及果蔬发酵食品中。产细菌素的植物乳杆菌不仅具有益生特性，而且具有抑菌特性。

[0004] 细菌素(bacteriocins)是由细菌核糖体合成，在靶细菌细胞膜上形成通道或直接抑制靶细菌细胞某些功能而高效发挥杀菌作用的蛋白或抗菌肽。细菌素能够抑制有害菌群的增殖。细菌素按分子大小可分为4类：Class I，其分子量<5kD；Class II，其分子量为5～10kD；Class III，其分子量>10kD；Class IV为大分子蛋白。Class I含有羊毛硫氨基酸和β‑甲基羊毛硫氨酸，含有19～50个氨基酸分子的小分子修饰肽。Class II不含羊毛硫氨基酸的细菌素。

[0005] 植物乳杆菌代谢产生的细菌素大多为Class I和Class II型，分子量小、结构稳定，容易被蛋白酶水解。植物乳杆菌代谢的细菌素一般为Class I。现有的植物乳杆菌代谢产生的细菌素通常抗菌谱窄，并且对酶和热稳定性差。

[0006] 因此，需要开发新型的植物乳杆菌以拓宽菌株的抗菌谱，甚至提高对酶和热的稳定性。

[0043] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

[0044] 定义

[0045] 除非另外定义，否则在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。

[0046] 本文所使用的表述“约”是如本领域的普通技术人员所理解的，并且根据其使用的背景而在一定范围内变化。如果本领域的普通技术人员根据其使用的上下文对该术语的使用不了解，则“约”将意味着特定值至多加上或减去10％。

[0047] 相比于一条序列，本文所使用的与该序列具有“至少85％序列同一性”可以包括与该序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。

[0048] 本文所使用的术语“重叠群”或称“contig”是指彼此可以通过末端的重叠序列相互连接形成连续的DNA长片段的一组克隆。

[0049] 本文所使用的术语“细菌素”或称“bacteriocins”是由细菌核糖体合成，在靶细菌细胞膜上形成通道或直接抑制靶细菌细胞某些功能而高效发挥杀菌作用的蛋白或抗菌肽。细菌素能够抑制有害菌群的增殖。植物乳杆菌代谢产生的细菌素大多为Class I和Class II型，分子量小、结构稳定，容易被蛋白酶水解。植物乳杆菌代谢的细菌素一般为Class I。
Class I含有羊毛硫氨基酸和β‑甲基羊毛硫氨酸，含有19～50个氨基酸分子的小分子修饰肽。Class II不含羊毛硫氨基酸的细菌素。

[0050] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)中进行了描述。

[0051] 实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0052] 实施例

[0053] 实施例1植物乳植杆菌FJ6‑1的筛选与鉴定

[0054] (1)菌株的筛选

[0055] 在无菌条件下，称取一定量的泡菜样品和液体汤汁，分别在无菌生理盐水和MRS液‑1体培养基中进行富集。取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水/MRS液体培养基中制成10 菌悬液，然后逐级稀释。各吸取100μL将稀释液涂布到MRS固体培养基和MRS+碳酸钙固体培养
0 ‑1 ‑2
基平板上。无菌生理盐水的菌悬液选取稀释梯度为10 、10 、10 。MRS液体培养基的菌悬液‑5 ‑6 ‑7
选取梯度为10 、10 、10 。涂好的平板倒置于30℃恒温培养48h，挑取长势良好，菌落饱满均匀的单菌落20个，于新鲜的MRS液体培养基中，30℃恒温培养2天。培养完毕后，7000r/min，4℃，10min离心去除菌体，获得发酵上清液。保留发酵上清液进行抑菌活性的测定。

[0056] 采用牛津杯琼脂扩散法验证抑菌活性，指示菌选择大肠杆菌(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。步骤如下：

[0057] 将5～7mL 1.5wt％无菌琼脂倒入无菌平皿中使其覆盖平皿底部，待凝固后，将灭菌后的牛津杯用镊子等距离放到琼脂平板上。将过夜活化的指示菌按照万分之一的比例加入到冷却至45℃左右的含有0.7wt％琼脂的LB培养基中，混合均匀后，取11～14mL倒入无菌琼脂平板中(不要倒入到牛津杯的孔里)，待完全凝固后，小心地用无菌镊子夹出牛津杯，在琼脂平板上的小孔中分别加入上述的发酵上清液100μL，然后将平板置4℃下2h使样品充分扩散，再转移到37℃下培养24h，观察抑菌现象，并测量抑菌圈直径(详见表1)。将有抑菌活性的发酵上清液对应的菌株FJ6‑1用甘油管保藏法冻存于‑80℃。

[0058] 表1 菌株抑菌活性的筛选结果

[0059]

[0060] 备注：‑表示无抑菌效果；+表示有轻微抑菌效果(抑菌圈直径<9mm)；++表示抑菌效果明显(9m<抑菌圈直径<13mm)；+++抑菌效果很明显(抑菌圈直径>13mm)。

[0061] MRS液体培养基的成分以质量比计包括：蛋白胨1％，牛肉膏粉0.8％，酵母膏粉0.4％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾(无水)0.2％，柠檬酸三氨(无水)0.2％，乙酸钠(含三水)
0.5％，硫酸镁(含七水)0.22％，硫酸锰(含四水)0.05％，吐温800.1％，蒸馏水。

[0062] MRS固体培养基的成分以质量比计包括：蛋白胨1％，牛肉膏粉0.8％，酵母膏粉0.4％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾(无水)0.2％，柠檬酸三氨(无水)0.2％，乙酸钠(含三水)
0.5％，硫酸镁(含七水)0.22％，硫酸锰(含四水)0.05％，吐温800.1％，琼脂粉2％，蒸馏水。

[0063] MRS+CaCO3固体培养基的成分以质量比计包括：蛋白胨1％，牛肉膏粉0.8％，酵母膏粉0.4％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾(无水)0.2％，柠檬酸三氨(无水)0.2％，乙酸钠(含三水)0.5％，硫酸镁(含七水)0.22％，硫酸锰(含四水)0.05％，吐温800.1％，琼脂粉2％，碳酸钙2％，蒸馏水。

[0064] LB液体培养基的成分以质量比计包括：胰化蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，蒸馏水。

[0065] LB固体培养基的成分以质量比计包括：胰化蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，琼脂粉0.75％，蒸馏水。

[0066] 无菌琼脂的配方：琼脂粉1.5％，蒸馏水。

[0067] (2)菌株的鉴定

[0068] 将步骤(1)分离的菌株FJ6‑1接种于MRS液体培养基中，30℃培养12h。按Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书方法提取该菌株的基因组DNA。以该菌株的基因组DNA为模板，27F(SEQ ID No:1)和1492R(SEQ ID No:2)为引物进行16s rDNA扩增，并对PCR扩增产物进行测序分析。

[0069] 获得的该菌株的16s rDNA的基因序列如SEQ ID No:3所示。在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，结果显示，该菌株与植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)的Identity＝99.51％(>97％)。因此，该菌株为植物乳杆菌

[0070] (Lactiplantibacillusplantarum)，将其命名为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)FJ6‑1，并于2022年8月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏号为CCTCC No.M20221260。

[0071] 该植物乳植杆菌FJ6‑1的形状为直或弯的杆状，菌落表面直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色。革兰氏阳性菌，不生芽孢。该菌株不能使明胶液化，发酵葡萄糖不产气，通常最适生长温度为30～35℃。

[0072] 实施例2植物乳植杆菌FJ6‑1菌种的培养：

[0073] (1)植物乳植杆菌FJ6‑1的生长曲线

[0074] 将植物乳植杆菌FJ6‑1从甘油管中接种至新鲜MRS液体培养基中于30℃恒温培养箱中过夜活化，作为种子菌。以0.1％的接种量将种子菌接种到100mL液体培养基中，以每孔200μL的添加量加入96孔板中，在全自动生长仪中30℃培养72h。培养期间，每隔1h测定菌悬液的OD600。植物乳植杆菌FJ6‑1的生长曲线如图1所示。由图1可知，植物乳植杆菌FJ6‑1在6h以前处于延迟期，6‑16h处于对数生长期，16h以后进入稳定期。

[0075] (2)植物乳植杆菌FJ6‑1的耐酸性

[0076] 将保藏的植物乳植杆菌FJ6‑1从甘油管中接种至新鲜MRS肉汤中于30℃恒温培养箱中过夜活化，作为种子菌。以0.1％的接种量将种子菌接种到100mL不同pH(pH＝2.5、4.5、7.5)的液体培养基中。以每孔200μL的添加量加入96孔板中，在全自动生长仪中30℃培养
12h。培养期间，每隔0.5h测定菌悬液的OD600。植物乳植杆菌FJ6‑1的耐酸性曲线如图2所示。
由图2可知，植物乳植杆菌FJ6‑1在起始pH＝7.5的MRS液体培养基中能够正常达到稳定期，在起始pH＝4.5的MRS液体培养基中生长受到轻微的影响，在起始pH＝2.5的MRS液体培养基中则几乎不能生长。可见，植物乳植杆菌FJ6‑1生长的pH为4.5～7.5。

[0077] (3)植物乳植杆菌FJ6‑1的发酵上清液的制备及其抗菌活性。

[0078] 将保藏的微生物菌株FJ6‑1从甘油管中接种至新鲜MRS液体培养基中于30℃恒温培养箱中过夜活化，然后以1％的接种量接种至新鲜MRS液体培养基中，30℃发酵48h得发酵液。发酵液7000r/min，4℃，10min离心去除菌体，获得发酵上清液。发酵上清液以牛津杯法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性，如图3所示。由图3可知，发酵上清液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有很好的抑菌活性。

[0079] MRS液体培养基的成分以质量比计包括：蛋白胨1％，牛肉膏粉0.8％，酵母膏粉0.4％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾(无水)0.2％，柠檬酸三氨(无水)0.2％，乙酸钠(含三水)
0.5％，硫酸镁(含七水)0.22％，硫酸锰(含四水)0.05％，吐温800.1％，蒸馏水。

[0080] 实施例3植物乳植杆菌FJ6‑1的细菌素提取物的制备及其抗菌活性

[0081] (1)细菌素提取物的制备

[0082] 将实施例2获得的1L发酵液在4℃下，7500r/min离心15min，除去菌体，获得上清液。向上清液中按照体积比为1:1的比例加入乙酸乙酯进行萃取，萃取4次，合并有机相，经过45℃旋转蒸发浓缩，待乙酸乙酯全部蒸发回收后，升高温度至50℃继续蒸发水分，浓缩至25mL，即为细菌素提取物粗品。以金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠杆菌(ATCC25922)为指示菌，用牛津杯法测定其抗菌活性，如图4所示。

[0083] (2)细菌素提取物粗品的抗菌活性

[0084] 按照上述的方法，分别制备不同指示菌(见表2)的牛津杯平板，在孔中分别加入100μL的细菌素提取物粗品，37℃恒温培养箱中培养12h，统计抑菌圈直径。做平行3次。

[0085] 表2 细菌素提取物粗品的抑菌谱

[0086]

[0087]

[0088] 由表2的抑菌结果可知，本发明的植物乳植杆菌FJ6‑1对表2中的菌株均有很好的抑菌效果。可见，本发明的植物乳植杆菌FJ6‑1的抑菌谱系宽泛。

[0089] 实施例4细菌素提取物的稳定性

[0090] (1)细菌素提取物的热稳定性

[0091] 按实施例3中的细菌素提取物的制备方法制备植物乳植杆菌FJ6‑1细菌素提取物。

[0092] 将细菌素提取物在80℃环境下水浴处理20min、40min和50min。以金黄色葡萄球菌为指示菌，取20μL热处理后的细菌素提取物，按照牛津杯法测定其抑菌活性(见图5)。如图5所示，不同时间热处理后，细菌素提取物的抑菌活性无明显减弱。

[0093] (2)细菌素提取物的酶稳定性

[0094] 本实验所采用的酶为Apain(木瓜蛋白酶)、Trypsin(胰蛋白酶)、Pepsin(胃蛋白酶)以及Proteinase K(蛋白酶K)。先将不同的酶分别溶解在其最适缓冲液中(缓冲液详情见表3)，配制的酶浓度均为10mg/mL。

[0095] 表3 不同的酶的最适缓冲液

[0096]

[0097]

[0098] 按实施例3中方法制备植物乳植杆菌FJ6‑1的细菌素提取物。

[0099] 取30μL的细菌素提取物，按照酶的终浓度为1mg/mL进行实验。加入酶溶液到固定的浓度之后，置于37℃水浴中4h充分反应。待处理完毕以后，收集样品。细菌素提取物的抑菌活性使用琼脂扩散法进行测定，以金黄色葡萄球菌为指示菌(见图6)。如图6所示，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后，细菌素提取物仍然保留了较好的抑菌活性。蛋白酶K处理后，细菌素提取物的抑菌活性消失。由结果可见，本发明的植物乳植杆菌FJ6‑1所产细菌素对木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶具有较好的耐受性。

[0100] 实施例5细菌素提取物粗品的鉴定

[0101] (1)基因组DNA提取

[0102] 取植物乳植杆菌FJ6‑1的过夜培养菌液2mL，按照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(B518225，生工生物，中国)说明书的方法对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性。利用Qubit进行定量，DNA的浓度为215ng/μL，OD280/OD260值为1.82，符合测序要求。

[0103] (2)二代Illumina平台测序

[0104] 经电泳检测合格的DNA样品用Covaris超声波破碎仪随机打断成长度约为350bp的TM片段。处理完成后的DNA片段，使用 Ultra  DNA Library Prep Kitfor 
Illumina(NEB,USA)试剂盒，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至2ng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，insert size符合预期后，使用Q‑PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。合格的文库通过Illumina Hiseq 4000测序平台对基因组DNA进行Paired‑End测序(2×150bp)。

[0105] (3)三代Nanopore测序

[0106] 先采用BluePippin全自动核酸片段回收系统对大片段DNA进行回收，再进行末端修复，选用Oxford Nanopore Technologies公司的EXP‑NBD104试剂盒PCR‑free的方法增加Barcode，后使用AATI全自动毛细管电泳仪检测片段大小，并对样品进行等摩尔混样，最后采用Oxford Nanopore Technologies公司的SQK‑LSK109连接试剂盒进行接头链接，构建10K文库，最后用Nanopore平台进行测序。

[0107] (4)基因组组装

[0108] 使用Unicycler软件(v0.4.7)对三代Nanopore数据和二代数据进行混合组装。三代组装软件：qminiasm+Racon，二代组装SPAdes，polishing软件Pilon。结果：组装后获得8个重叠群(contig)，总大小为3,556,373bp，GC含量44.13％。

[0109] (5)细菌素的鉴定

[0110] 将组装后获得的植物乳植杆菌FJ6‑1基因组序列加载到Bagel4和antiSMASH数据库中进行细菌素鉴定。除了已知的植物乳杆菌素EF(plantaricin EF)外，还鉴定到两种新型的细菌素，这两种新型的细菌素的氨基酸序列与已知的任何一种细菌素的氨基酸序列不完全相同。将其分别命名为植物乳杆菌素Y61(plantaricin Y61)和植物乳杆菌素LB61(plantaricin LB61)，各自的氨基酸序列如下：

[0111] 植物乳杆菌素Y61的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。

[0112] 植物乳杆菌素LB61的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。

[0113] 植物乳杆菌素EF中的植物乳杆菌素E的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；植物乳杆菌素F的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。

[0114] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0115] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0116] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。