[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌及其在农药中的应用。

[0002] 随着设施栽培蔬菜瓜果技术的日益普及，也造成了病害不分季节的严重发 生，设施栽培可以提供反季农产品和提高产量，但常期的温暖和湿度大及连茬 栽培，使灰霉病菌基数逐年增多，灰霉病菌除主要危害番茄外，还可危害害茄 子、辣椒、黄瓜、瓠瓜等20多种作物，造成茎叶枯死和烂花、烂果，直接影 响产量，减产20-50％，成为保护地作物常见且比较难防治的病害。大量使用的 化学农药对蔬菜和瓜果造成污染，其毒性和潜在的致癌作用对人体健康构成危 胁。生物农药以其对非靶标生物比较安全和环境相容性好的突出优点而符合现 代社会对农业生产的要求。

[0003] 在所有的生物资源中，微生物以其繁殖快，成本低，野生菌株较易改造从 而快速提高产量的特点，成为农药研制的首选资源。目前世界范围微生物农药 销售额达数亿美元，且年产值每年上升10％～20％。为解决陆源微生物获得新 农药性状日益减少的现状，极端海洋微生物新资源开始受到关注，海洋尤其深 海独特的地理位置及高盐、低温等原始环境，造就了生物的多种适应性生存， 具备独特的分子生物学机制和生理生化特性，产生新型的代谢物质可以被人类 所利用。

[0004] 我国土壤盐渍化较严重，盐渍化土壤约占耕地的1/3，鉴于人多地少的特点， 这些盐渍化土壤仍被人们所利用栽种较耐盐的作物，目前国内外开发微生物农 药由于生防菌都来源于陆地，在含盐量较高的土壤中难以存活、定殖，在盐渍 地土传病害的防治效果较差，陆地生防菌由于生境原因，限制了其发挥作用。 海洋微生物高盐的原始生境，更易在盐渍土壤发挥作用，在新农药开发领域显 现其生境优势。

[0005] 生物农药的活菌制剂是一类相对开发周期较短，资金需求相对较少，农药 功能较全的产品。在已获登记的陆地微生物活菌制剂尤其是芽孢杆菌，在生物 农药中占有较大的比例，并在植物病害的防治中起了重要作用。农药菌株为了 更好的为人类所利用和产业化生产，菌株要满足农药活性及生产发酵性状均达 标的条件，微生物菌株通过各种筛选模型获得后，通常都进行诱变育种，如操 作的成功，其经济价值可在野生菌株的基础上提高几百甚至上千倍，诱变育种 获得的HTTA-X0189菌株，不但对植物危害较大的病原菌具有优良和广谱的抑菌 特性，还具有良好的人工发酵培养生产的特性。

[0006] 芽孢杆菌以抑菌活性强而著称，脂肽类物质是芽孢杆菌产生的主要的抑菌 物质，主要由ituC，fenD，bmyB，srfAA，srfAB，bioA等生防基因控制合成。ituC、 fenD和bmyB控制合成具有强烈抑菌作用的伊枯草菌素、丰原素和细菌素的关 键基因，srfAA和srfAB是控制合成表面活性素的关键基因，表面活性素可加强 伊枯菌素和丰原素的抑菌活性，同时srfAA，srfAB与bioA共同参与生物膜的形 成，在植物根部形成生物膜，有效阻止病原菌对植物根部的侵害，由于基因测 试的敏感性和准确性，菌株这些基因确定再配合生物测定有助于评估菌株的农 药潜力。

[0024] 以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应 理解成对本发明的限制。

[0025] 1.芽孢杆菌菌株的分类鉴定

[0026] 芽孢杆菌HTTA-X0189菌株，在固体蛋白胨培养基:蛋白胨4g，酵母粉2g， NaCl,15-25g，KCl 0.2-0.4g，MgCl2·7H2O 1.5-2.5g，水1000ml，pH 7.0，琼脂 16-19g,25℃-27℃培养2-3天，观察记录菌落形态、颜色等变化，显微镜观察菌 体形态，细菌鉴定常规方法测试其生理生化反应。菌株经上述方法培养，利用 细菌16SrDNA基因的通用引物，常规方法PCR扩增产物测序，并通过NCBI的 BLAST程序进行对比，分析序列同源性及做亲缘关系分枝树(见图1)比较近缘 种类。

[0027] 结果证明，生长正常的特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌落表面粗糙不透明， 培养初期菌落为白色，后期转为褐色，菌落大而平铺，不透明，表面有皱折， 边缘不圆整，革兰氏染色阳性，显微镜下菌体直杆状或近直杆状，周生鞭毛， 有椭圆形芽孢，芽孢中生偏侧，菌体能运动。兼性厌氧，接触酶反应阳性，精 氨酸双水解酶反应阳性，V-P反应阴性，吲哚反应、H2S反应阴性，能利用葡萄 糖产酸，不能使硝酸盐还原为亚硝酸盐。

[0028] 表1特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株的生理生化反应

[0029]

[0030] 结合菌落形态、生理生化反应与分子生物学信息，参考国内外相关芽孢杆 菌分类鉴定专著，鉴定菌株为：特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis。

[0031] 2.芽孢杆菌重要的抑菌基因验证测试

[0032] 在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上检索到芽孢杆菌重要的抑菌基因， 控制合成具有强烈抑制病原菌作用的伊枯草菌素和丰原素ituC和fenD细菌素的 关键基因bmyB，控制合成表面活性素的关键基因srfAA和srfAB，参与生物膜 的形成关键基因srfAA，srfAB与bioA，利用Premier 5.0设计对应的引物，PCR 常规方法扩增，对菌株是否产生抑菌活性的特性进行基因验证。

[0033] 结果证明，从芽孢杆菌HTTA-X0189菌株基因组中检测存在上述所有的基 因，扩增到的基因大小见下表，由此可知该菌株具有良好的抑菌活性基础

[0034] 表2芽孢杆菌HTTA-X0189菌株的抑菌基因

[0035]抑菌基因 ituC fenD srfAA srfAB bioA bmyB
扩增到的基因大小(bp) 580 293 275 310 210 398

[0036] 3.实验室植物离体抑菌活性测试

[0037] 特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株，经上述培养基培养3天，采用常规对 峙培养法对农业常见和危害严重的10种植物病原真菌：稻瘟霉菌Pyricularia oryzae、茄链孢菌Alternaria salani、镰孢霉菌Fusarium oxysporrum、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、大丽轮枝菌Verticillium dahliae、芽枝霉菌Cladosporium fulvum、辣椒疫霉  菌Phytophthora capsici、丝核菌Rhizoctonia solani、赤霉菌Fusarium graminearum、菌 核菌(Sclerotina sclerotiorum)测试抑菌活性及计算抑菌率(对病原菌的抑制率 ＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％)。结果如下：

[0038] 表3 HTTA-X0189对植物病原菌抑菌活性

[0039]

[0040] 注释：植物病原菌：Po：Pyricularia oryzae；As：Alternaria salani；Fo：Fusarium oxysporum； Bc:Botrytis cinerea；Vd:Verticillium dahliae；Cf:
Cladosporium fulvum；Pc:Phytophthora capsici； Rs:Rhizoctonia solani；Fg：
Fusarium graminearum；Ss:Sclerotina sclerotiorum。

[0041] 芽孢杆菌HTTA-X0189菌株对10种农业常见和危害严重的病原真菌，具有 很好的抑菌效果，在对峙培养测试中，对病原菌的活性都达到强抑制作用，抑 菌圈都38mm以上，抑菌率达82.0-96.3％，显示强抑菌活性，具有良好的研制 新杀菌剂的潜力。

[0042] 4.植物活体防治病害测试(植物盆栽试验及田间小区试验)

[0043] 植物活体防治病害测试采用常规方法进行，盆栽植物苗培养至3-4片真叶， 每次盆栽试验用苗不少于60棵，田间小区试验小区面积25m2以上，田间盐渍 土壤小区防治试验，盐渍土壤选择即墨靠海近的自然盐渍耕地，氯化物盐约0.2- 0.3％，盆栽盐渍土壤采用人工培制的模拟盐渍土，每个处理不少于3个重复， 接种发病或自然发病，用特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株发酵稀释液进行防 治，以农业生产防治该病常用的传统农药做为阳性对照，同浓度的无菌发酵液 处理做为空白对照，6-7天后调查病情，计算防治效果。

[0044] 表4 HTTA-X0189菌株对盆栽番茄灰霉病的防治效果

[0045]

[0046]

[0047] 表5 HTTA-X0189对田间小区番茄灰霉病的防治效果

[0048]

[0049] 表6盐渍地HTTA-X0189对辣椒疫霉病的田间小区药效

[0050]

[0051] 表7盐渍地HTTA-X0189对甘蓝白粉病的田间小区药效

[0052]

[0053] 上述防治结果证明，特基拉芽孢杆菌HTTA-X0189菌株对番茄灰霉病防治有 特效，盆栽或田间小区防治番茄灰霉病，防效都超过了90％，盐渍土壤防治辣 椒疫霉病和甘蓝白粉病防治效果也超过或达到化学药剂的水平

[0054] 5.第三方验证结果

[0055] 为了经第三方确认菌株的农药潜力，与德国BASF合作期间，在双方签署 对菌株的保密协议前提下，BASF在德国对番茄灰霉病Botrytis cinerea，小麦赤 霉病Fusarium graminearum进行了多次防治病害测试验证并提供了防治结果。 BASF试验结果也证实对番茄灰霉病的防治效果非常好达90-100％鉴于德国 BASF公司在世界农药研制与开发领域的知名度，他们的结果是对特基拉芽孢杆 菌HTTA-X0189农药潜力的最好的验证。

[0056] 表8 BASF公司在德国生测结果

[0057]

[0058] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以 对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范 围内。