技术领域
[0001] 本发明涉及一种相近芽孢杆菌的区分方法。
相关背景技术
[0002] 1970年Colwell提出的多相分类(Polyphasic taxonomy)方法是区分微生物领域各级分类单元的最有效的手段，也更客观反应生物间自然系统进化关系的分类方法。该分类方法数据和信息有3种类型类：分别是表型、基因型和系统发育型。表型信息包括：培养形态、生理生化指标、细胞壁化学组成和磷酸类脂、醌、全细胞脂肪酸等细胞化学的分析,还有全细胞可溶性蛋白电泳及核糖体蛋白图谱共8类；基因型信息来自于对细胞核酸分子的分析，GC含量测定、核酸杂交、限制性片段长度多态性、随机扩增DNA片段多态性的分析等；而系统发育信息责是采用一些特定的基因片段作作为分析对象，这些基因就是系统发育标记(Phylogenetic Markers)。用编码蛋白质基因作为系统发育基因越来越得到行业内的认同，系统发育标记是表示遗传关系的标识，应用不同的标记再结合其它分类信息可以将细菌的遗传关系及分类单元确定到种、属、科等不同的等级。
[0003] 芽孢杆菌(Bacillus.sp)是革兰氏阳性菌的一种，因为芽孢杆菌属的菌株具有易于培养和储存的诸多优点，比其他微生物菌种更适用于生物防治领域研究。特别是枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌已经被证明可产生促进植物生长作用的赤霉素和吲哚乙酸，胞外植酸酶物质，几丁质酶和抗真菌多肽，应用于农作物可显著提高作物产量。
[0004] 枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌属于形态特征相似的芽孢杆菌属，具有很近的亲缘关系，致使很早以前人们将解淀粉芽孢杆菌称为枯草芽孢杆菌的亚种，在1967年Welker等人研究，确定解淀粉芽孢杆菌是独立的有效物种之一。正是因为枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌为近缘菌种，仅仅通过生理生化反应和16SrRNA技术，甚至包括应用梅里埃的API菌种鉴定条都不能有效区分，因此传统的菌株分类方法受到了挑战，急需更具分辨力的技术来进行枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的分类鉴定工作。
具体实施方式
[0016] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0017] 具体实施方式一：本实施方式枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的区分方法按以下步骤进行：
[0018] 一、获取待鉴定芽孢杆菌CheA基因；
[0019] 二、与已知枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌模式菌株的CheA基因进行同源性比较，同源性低于80％的为异种芽孢杆菌。
[0020] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中选Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168作为已知枯草芽胞杆菌的模式菌株；选Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42作为已知解淀粉芽孢杆菌的模式菌株。其它步骤及参数与实施方式一相同。
[0021] Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168全基因组登陆号为GI:728882887；Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42，全基因组登录号为GI:
154350369。
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例采用BLASTN 2.2.30+比对模式菌株(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168和Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42)基因组的16SrRNA、GyrA、GyrB、CheA和GroEL基因之间的同源性。
[0024] 本实施模式菌株比对点阵分析(Dot Matrix View)图如图1所示。模式菌株基因之间同源性测试结果如表1所示。模式菌株比对分析结果如图2所示。
[0025] 表1
[0026]基因 16SrRNA GyrA GyrB CheA GroEL
同源性 99％ 81％ 82％ 77％ 93％
[0027] 图1和图2显示Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168与Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42之间有区别，80％的核酸具同源性，另外20％的序列在两种菌株中存在明显差异，进一步证明枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌应分属不同的种。
[0028] 经过比对枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌两个模式菌株的五条基因(16SrRNA、GyrA、GyrB、CheA和GroEL)中CheA基因的同源性最低为77％，适合用于区别、鉴定枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌。而枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的16SrRNA同源性最高达到99％，无法对两种菌加以区分。
[0029] 实施例2
[0030] 以美国国立生物技术信息中心网站GenBanK数据库中存储的枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌菌株为对照菌株进行验证。
[0031] 采用BLASTN 2.2.30+在线软件分别比较Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168与GenBank数据库中Bacillus amyloliquefaciens基因的同源性，以及Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42与GenBank数据库中Bacillus subtilis的同源性。比对基因为5个，16SrRNA、GyrA、GyrB、CheA和GroEL。
[0032] 比对结果：
[0033] 1、Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168与GenBank数据库中Bacillus amyloliquefaciens的16sRNA序列同源性均在99％以上。Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42与GenBank数据库中Bacillus subtilis的16sRNA序列同源性均在99％以上。
[0034] 2、Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168与GenBank数据库中Bacillus amyloliquefaciens的GyrA基因序列同源性在81％～87％，GyrB基因同源性在79％～82％，GroEL基因同源性在93％～98％，CheA基因同源性在68％～77％。
[0035] 除了Bacillus subtilis strain Bs-916、Bacillus subtilis strain ATCC 19217、Bacillus subtilis strain B-1和Bacillus subtilis strain ATCC 13952之外，Bacillus amyloliquefaciens FZB42与GenBank数据库中Bacillus subtilis的GyrA基因序列同源性在81％～83％，GyrB基因同源性在78％～82％，GroEL基因同源性在92％～
99％，CheA基因同源性在70％～77％。Bacillus amyloliquefaciens FZB42与Bacillus subtilis strain Bs-916、Bacillus subtilis strain ATCC 19217和Bacillus subtilis strain B-1的GyrA、GyrB、CheA和GroEL基因序列同源性均达到99％；Bacillus amyloliquefaciens FZB42与Bacillus subtilis strain ATCC 13952的GyrA、GyrB、CheA和GroEL基因序列同源性达到了95％～96％。分析认为Bacillus subtilis strain Bs-
916、Bacillus subtilis strain ATCC 19217、Bacillus subtilis strain B-1和Bacillus subtilis strain ATCC 13952菌种分类有误，这也说明原有枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌区分和分类不准确。
[0036] 经过实施例1和2的比对获知枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的16SrRNA基因不能用于区分两种芽孢杆菌，而两种芽孢杆菌的GroEL基因同源性也相对较高，因此16SrRNA基因和GroEL基因都无法对枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌做出区分。两种芽孢杆菌的GyrA和GyrB基因同源性虽然在78％～82％左右，但是考虑两种模式菌株基因组同源性为80％，并不适合作为枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的区别。
[0037] 两种芽孢杆菌的CheA基因同源性低，能够准确的加以区分。分别根据枯草芽孢杆菌CheA基因和解淀粉芽孢杆菌CheA基因构建系统发育树，结果如图3和图4所示。上述结果显示，用Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168和Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42的CheA基因在不限定物种的前提下进行BLAST分析比对分析并绘制系统发育树，NCBI数据库中枯草芽孢杆菌168的CheA基因相似性均达到92％以上，尤其是完成基因组测序的枯草芽孢杆菌相似性可达到95％，多数菌株相似性为100％，与解淀粉芽孢杆菌最高相似性为76％，最低为70％。解淀粉芽孢杆菌FZB42的CheA基因与数据库中解淀粉芽孢杆菌相似性均达到95％以上，与枯草芽孢杆菌相似性为71％～78％。两种模式菌株的系统发育树也可以看到，分别以两条CheA基因分别构建系统发育树，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分属于不同分支，且芽孢杆菌属内的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)均处于独立分支范围，可见CheA基因在芽孢杆菌属内具有非常高的辨识度。通过以上结果可以证明应用CheA基因完全能够区分枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。
