[0001] 本发明涉及发酵工程领域，具体涉及一种促使枯草芽孢杆菌产芽孢的方法。

[0002] 枯草芽孢杆菌是在自然界广泛存在的一种好氧的产芽孢杆菌。它具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等活性，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，在畜牧业饲料行业应用广泛。枯草芽孢干菌是饲用微生态制剂的常用菌种之一，芽孢杆菌在成熟期以孢子状态存在，具有天然耐酸和耐胆盐等优点。枯草芽孢杆菌通过定植到目标动物肠道中，经生物夺氧作用，颉颃致病微生物，并产生多种消化酶及营养物质，产生有益代谢产物。所以枯草芽孢杆菌不仅可以改善原料风味，更重要的是它可调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，最终预防疾病的发生，达到促进目标动物生长和提高饲料转化率的目的，因而枯草芽孢杆菌被越来越多地研制成饲用微生态制剂。

[0003] 发酵培养基配方是影响微生物发酵的重要因素之一。一般认为，芽孢是细菌营养体在必须养料耗尽时，特别是碳源、氮源或磷酸盐的不足的情况下，在细胞内形成的含水量低，抗逆性强的休眠体。研究表明，枯草芽孢杆菌所产生的芽孢具有耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂等多种抗逆性。由于芽孢极强的抗逆性，在工业机械化生产及高温干燥的过程中，可以保证益生菌剂的活性，提高产品质量。

[0004] 目前，工业生产过程中主要存在芽孢形成时间长，出芽率低等问题。因此，促进枯草芽孢杆菌产芽孢是较有益的研究方向。

[0008] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0009] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，培养基的pH均指初始pH值，也即灭菌前的pH值，其它成分亦然，均为配制时(灭菌前)的用量；使用的“CFU”为菌落形成单位，可以通过平板菌落计数法测得。

[0010] 本发明提供的促使枯草芽孢杆菌产芽孢的方法包括将枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行培养，所述培养的条件包括：28-32℃，95-120rpm(优选包括：30±0.5℃，100±5rpm)；枯草芽孢杆菌的接种量为2×107-8×107CFU/ml发酵培养基；所述发酵培养基含有0.2-0.5重量％的酵母浸粉，0.5-1重量％的糖蜜和0.3-0.8重量％的葡萄糖，且pH 7-7.5。

[0011] 根据本发明的优选实施方式，所述发酵培养基含有0.3-0.35重量％的酵母浸粉，0.7-0.9重量％的糖蜜和0.5-0.7重量％的葡萄糖，且pH 7.2-7.4。在更优选的实施方式中，所述发酵培养基含有0.32±0.01重量％的酵母浸粉，0.8±0.01重量％的糖蜜和0.6±0.01重量％的葡萄糖，且pH 7.2-7.4。

[0012] 本发明的方法可以缩短枯草芽孢杆菌的芽孢出芽时间，因此，所述培养的时间可以不长于15小时，优选为8-15小时，更优选为9-10小时。

[0013] 根据本发明，为了使枯草芽孢杆菌适应培养环境，所述方法还可以包括在培养前将枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中进行活化。

[0014] 根据本发明的一种优选实施方式，所述种子培养基含有0.4-0.8重量％的酵母粉，0.5-1.2重量％的蛋白胨，0.4-0.6重量％的葡萄糖和0.8-1.2重量％的氯化钠，且pH 7.2-
7.4。在更优选的实施方式中，所述种子培养基含有0.5±0.01重量％的酵母粉，1±0.01重量％的蛋白胨，0.5±0.01重量％的葡萄糖和1±0.01重量％的氯化钠，且pH 7.2-7.4。

[0015] 根据本发明的一种优选实施方式，所述活化的条件包括：28-32℃，110-130rpm，终点OD600值0.1-0.2(更优选包括30±0.5℃，120±2rpm，终点OD600值0.1±0.05)。此外，活化时，枯草芽孢杆菌的接种量优选为1×106-4×106CFU/ml种子培养基。

[0016] 根据本发明一种特别优选的实施方式，所述方法包括：

[0017] (1)将枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中进行活化，所述活化的条件包括30±0.5℃，120±2rpm，终点OD600值0.1±0.05；枯草芽孢杆菌的接种量为1×106-4×106CFU/ml种子培养基；所述种子培养基含有0.5±0.01重量％的酵母粉，1±0.01重量％的蛋白胨，0.5±0.01重量％的葡萄糖和1±0.01重量％的氯化钠，且pH 7.2-7.4；

[0018] (2)再将活化后的枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行培养，所述培养的条件包括：30±0.5℃，100±5rpm；枯草芽孢杆菌的接种量为2×107-8×107CFU/ml发酵培养基；所述发酵培养基含有0.32±0.01重量％的酵母浸粉，0.8±0.01重量％的糖蜜和0.6±0.01重量％的葡萄糖，且pH 7.2-7.4。

[0019] 在该优选的实施方式中，所述培养的时间可以进一步缩短至不长于9.5小时(如9或9.5小时)。

[0020] 本发明中使用的培养基一般含有水，含量根据需要进行选择。本发明的培养基含有上述成分或由以上成分和水组成。其中，酵母浸粉、酵母粉、蛋白胨和糖蜜均为常规的用来配制微生物的培养基的物质，可以通过商购获得。

[0021] 本发明中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可以为本领域常用的各种枯草芽孢杆菌，可以通过商购获得。

[0022] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0023] 以下实施例中，酵母粉、蛋白胨和酵母浸粉均购于安琪酵母公司；糖蜜和玉米浆为TM中粮生物化学(安徽)股份有限公司的市售品；枯草芽孢杆菌购自ATCC， 6633 。

[0024] 实施例1-2

[0025] (1)将保存在超低温冰箱中的枯草芽孢杆菌提前0.5h自然解冻，然后接种至种子培养基中进行活化，所述活化的条件包括30℃，120rpm，终点OD600值0.1；枯草芽孢杆菌的接种量为2×106CFU/ml种子培养基；所述种子培养基含有0.5重量％的酵母粉，1重量％的蛋白胨，0.5重量％的葡萄糖和1重量％的氯化钠，余量为水，且pH 7.2-7.4；

[0026] (2)再将活化后的枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行培养，培养的条件和接种量见表1；所述发酵培养基含有0.32重量％的酵母浸粉，0.8重量％的糖蜜和0.6重量％的葡萄糖，余量为水，且pH 7.2-7.4；

[0027] 在培养过程中，0h、开始启动时后每隔3h取样镜检，菌落计数，直到染色镜检得出出芽率在95％以上，停止培养。

[0028] 其中，出芽率的测试方法为：每个样取3ml，取其中的0.1ml稀释涂布平板计算活菌总数。产芽孢后，原液进行80℃水浴10min，涂布平板计算芽孢个数，并根据公式“出芽率＝芽孢个数/活菌总数×100％”计算出芽率，结果如表1所示。

[0029] 对比例1

[0030] 按照实施例3的方法培养枯草芽孢杆菌，不同的是，发酵培养基中的“0.32重量％的酵母浸粉”替换为“1.5重量％的玉米浆”，结果如表1所示。

[0031] 对比例2-3

[0032] 按照实施例3的方法培养枯草芽孢杆菌，不同的是，步骤(2)中，按照表1示出的接种量接种，结果如表1所示。

[0033] 对比例4

[0034] 按照实施例3的方法培养枯草芽孢杆菌，不同的是，所述发酵培养基含有0.6重量％的酵母浸粉，0.32重量％的糖蜜和0.8重量％的葡萄糖，结果如表1所示。

[0035] 表1

[0036]

[0037] 通过表1的结果可以看出，采用本发明优选的培养温度的实施例1具有比实施例2明显更好的效果，虽然实施例1的出芽时间略长于实施例2，然而总芽孢数量和出芽率都优于实施例2。另外，比较实施例1与对比例1-4可以看出，只有按照本发明的方式控制发酵培养基的种类和接种量才能够有效缩短出芽时间，并提高芽孢数量和出芽率。

[0038] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。