技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）DS3。
相关背景技术
[0002] 皂素（如薯蓣皂素）生产废水具有废水量小、色度大、有机物浓度高、酸度大、温度高等特点，可生化性差，是一种非常难处理的废水。
[0003] 根据《皂素工业水污染物排放标准》（GB20425-2006）中具体规定，自2009年起COD排放量应低于300mg/L。目前皂素水解原液COD浓度达到20000-40000mg/L，综合废水COD浓度约为4000-12000mg/L。若直接排入水体，会导致水体的有机污染物浓度大幅度增加，由此引起江河湖泊严重污染，不仅直接影响了人们的生存环境，也造成了国民经济的巨大损失。
[0004] 皂素废水中含有大量有机污染物，其中部分毒性醛、酮、酚类物质对污水处理系统里污泥中的微生物具有抑制作用，一般微生物不能正常生长。
[0005] 同时，皂素废水中硫酸根浓度高，约为8000mg/L左右，在高盐度废水的生物处理系统中，由于盐度的变化往往会破坏微生物的细胞膜和菌体内的酶，致使污泥活性下降。同时，微生物对环境具有一定的适应能力，在一定盐度范围内微生物通过自身的渗透调节机制平衡细胞内的渗透压或保护细胞内的原生质，调节自身新陈代谢以适用盐度的变化。活性污泥在含盐环境中经过一段时间驯化后，将具有一定的耐盐性。
[0006] 目前对皂素废水的处理多采用物理或化学的方法，现有技术中还没有微生物降解方法和用于降解皂素废水有机污染物的菌株的报导。
具体实施方式
[0012] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，当然下述实施例不应理解为对本发明的限制。
[0013] 一、枯草芽孢杆菌DS3的筛选：（一）、材料准备：
1、实验废水和池底污泥取自湖北省十堰市某黄姜皂素生产厂生产排放废水的生化处理系统。
[0014] 2、培养基：筛选培养基：3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，20g/L琼脂，pH6.8。
[0015] 富集培养基（g/L）：30g/L 磷酸氢二钾，100mg/L无水硫酸镁，10g/L磷酸二氢钾，10mg/L四水硫酸锰，5g/L硝酸铵，10mg/L七水硫酸亚铁，1g/L硫酸钠，5mg/L氯化钙，冰箱保存。使用时，稀释10倍，加入10%葡萄糖，pH值7.0～7.2。
[0016] LB液体培养基：蛋白胨 10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠 10.0g/L，蒸馏水1000mL，pH7.0。
[0017] LB固体培养基：蛋白胨 10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，蒸馏水1000mL，琼脂15g/L（固）， pH7.0。
[0018] LB斜面培养基：蛋白胨 10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化钠10.0g/L，蒸馏水1000mL，琼脂20g/L（固），pH7.0。
[0019] 3、实验仪器和设备：国华SHA-B恒温振荡器，
东器SPX生化培养箱，
立式压力蒸汽灭菌器，
光学显微镜-----Olympus有限公司，
pH计等----- sarporiusPD-10，
超净工作台，
PTC200型PCR仪，
电泳仪及电泳槽，
UVP凝胶紫外观测仪。
[0020] （二）、菌株的筛选分离与纯化：1. 筛选分离：
1) 称取2克黄姜皂素生产厂废水处理系统中酸化池尾区的池底污泥样品，加入事先灭菌好的装有100mL 无菌水的 250mL 的三角瓶内，30℃恒温振荡200rpm，将菌胶团打碎，得泥水混合物，备用；
2) 将泥水混合物转入装有100mL筛选培养基的500 mL锥形瓶中，30℃恒温静置培养至培养基浑浊，得到菌悬液A；
3) 取5 mL菌悬液A于装100 mL新鲜的筛选培养基的250 mL锥形瓶中培养一周；将培养一周后的菌悬液取5 mL于装100 mL新鲜的筛选培养基的250 mL锥形瓶中培养一周，重复操作5-6次，最后得到的菌悬液B；
2. 用无菌移液管吸取0.5mL上述菌悬液B，稀释涂布于固体培养基上。37℃左右恒温培养3d，挑取在菌落特征上有明显差异的单菌，在LB固体培养基上反复划线培养三次直至获得单一菌株，并于LB斜面培养基上保存，得到一株菌株DS3，即枯草芽孢杆菌DS3。
[0021] 二、枯草芽孢杆菌DS3的鉴定：1、对枯草芽孢杆菌DS3的鉴定：
对枯草芽孢杆菌DS3进行了生理生化的鉴定、16S rRNA分子的鉴定并结合Biolog微生物自动分析系统，从分子水平确定枯草芽孢杆菌DS3的种属。
[0022] 16S rRNA序列分析主要按照以下步骤：1) 细菌核DNA的提取
使用北京百泰克生物技术有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒。
[0023] 2) 16S rRNA基因的PCR扩增PCR扩增引物参照Weisburg等人（Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. J. Bacteriol, 1991,
173: 697–703）的方法合成。
[0024] P1：正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’P2：反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’
在50mL反应体积中，加入1mL模板DNA（0.1mg），0.5mL P1和 P2 （终浓度为0.5mM），
1mLdNTP （每种NTP0.2 mM），0.5mLTaq聚合酶（2 U）和5 mL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72゜C终延伸10 min。
[0025] 3)PCR产物的回收将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入
1.5mL离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用浓度为70%乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。
[0026] 4)16S rDNA的全序列测定和分析PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人（Hiraishi A, Shin Y K, Ueda Y. Automated Sequencing of PCR-amplified 16S rDNA on ‘Hydrolink’ Gels[J]. J. Microbiol. Methods, 1994, 19: 145－154）方法合成。
[0027] P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；P-r：GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
[0028] 加入1mL模板DNA （<0.1mg），PCR扩增30个循环（94゜C 1 min，55゜C 30s，72゜C 2min）。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem373 A DNA 测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank 数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。
[0029] 2、16S rRNA序列测定：本发明采用对16SrRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为
1437bp的扩增带（用1％琼脂糖凝胶电泳检测），如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列，其序列见SEQ ID NO: 1。
[0030] 三、菌落形态特征以及生理生化特性：枯草芽孢杆菌DS3的菌落形态为：菌落呈白色或淡黄色、不透明、圆形、表面粗糙，中间有皱起、边缘不整齐；需氧，革兰氏阳性芽孢杆菌。最适生长pH值：6.5～7.5，最适生长温度：25-35 ℃。不能在60 ℃生长。
[0031] 四、枯草芽孢杆菌DS3为新的菌株：采用BLAST分析法对菌株DS3的16S rRNA基因序列与GenBank 数据库比较分析发现，菌株DS3与枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）的同源性高达99.0%。
[0032] 综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株DS3命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）DS3。查阅有关资料，尚无枯草芽孢杆菌属有关降解皂素废水能力研究的报道。枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）DS3为新的菌株，已于2010年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC M 2010146。
[0033] 本发明从湖北省十堰市某黄姜皂素生产厂排放废水的生化处理系统污泥中筛选分离出这一株细菌，并发现其有较好降解皂素废水中有机污染物的功能。这拓宽了人们对枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）在其功能方面的应用研究思路，并为降解高浓度有机污染物黄姜皂素废水及其他皂素废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。
[0034] 五、枯草芽孢杆菌DS3的应用：挑取活化后的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）DS3单菌落，于LB液体培养基中培养过夜，按培养后的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）DS3：皂素废水（即实验废水，取自湖北省十堰市某黄姜皂素生产厂排放废水的生化处理系统）的体积比为0.5-2：100接种，
30-35℃恒温培养，pH值为6-8，反应48-72小时。
[0035] 在本实施例中，具体的应用方法为：用接种环挑取单菌落DS3，于50mL LB液体培养基中30℃震荡培养过夜；取1mL菌液接种于9mL皂素废水（脱酸水初始COD 4700 mg/L左右、pH1.28）中；另取一支装有9mL皂素废水的试管，加入1mL LB液体培养基作为空白对比。调节水样pH值约为7.0，置于35℃、150rpm振荡培养3d，测定水样的COD值，从而计算得到菌株对废水的COD去除效率。该菌株能在72小时之内去除皂素废水中的COD2150mg/L，去除效率达到50.71%。
[0036] 需要说明的是，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
