技术领域
[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一株芽孢杆菌，以及其在防治马铃薯疮痂病中的应用。
相关背景技术
[0002] 马铃薯生产实践中多采用块茎繁殖，土传病原菌从块茎、根等部位进入马铃薯植株后可通过种薯代代相传，危害面积大，严重影响马铃薯生产安全。
[0003] 其中，疮痂病是全球马铃薯种植区流行的重要土传病害之一，属于细菌性病害，感病后对马铃薯的品质影响很大。
[0004] 马铃薯疮痂病：由腐生性丝状的链霉菌Streptomyces scabies和其他多种植物致病性链霉菌Streptomyces spp.引起的一种马铃薯土传病害，主要危害块茎，初期薯块表皮产生褐色斑点，病斑分散，带病种薯长出的植株极易发病，健株播种在带菌的土壤中也能发病。疮痂病菌是放线菌科链霉菌属，侵染马铃薯块茎后会降低马铃薯产量及马铃薯产业的整体效益。
[0005] 已有报道显示土壤微生物调控能够实现作物增产20％，减少20％的化肥与杀虫剂的农业投入，是未来环境友好、经济可行的绿色农业新出路。
[0006] Sang‑Moo Lee等人系统分析了番茄青枯病发病根际土壤(diseased rhizosphere soil，DRS)和健康根际土壤(healthy rhizosphere soil，HRS)的微生物群落结构，并以HRS的微生物浸提液对番茄幼苗浸根处理，发现番茄青枯病的发生与根际土壤中厚壁菌门和放线菌门微生物失调相关；马爽等人筛选鉴定了一株贝莱斯芽孢杆菌K‑9并分析确定了其对马铃薯疮痂病具有较好的生防效果；李昊宇等从马铃薯根际土中分离得到1465株微生物，通过平板对峙试验，初步筛选出71株对马铃薯黄萎病菌和马铃薯枯萎病菌具有拮抗效果的菌株，其中XS142、XS146、XS107、XS156、DS86菌株对马铃薯黄萎病菌、马铃薯枯萎病菌、晚疫病菌和黑痣病菌均有拮抗作用；熊悯梓等分别从宁夏回族自治区、河北省、内蒙古自治区采集马铃薯疮痂病害发生情况不同的3组土壤样品，并分析了3组样品微生物群落结构差异，挖掘到多株拮抗菌并复配获得效果良好的菌剂。
[0007] 长期以来，马铃薯育种领域和病害防控领域的科学家更多的关注马铃薯晚疫病，疮痂病并未受到足够的重视。
具体实施方式
[0033] 下面结合具体实施例进行说明。
[0034] 为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
[0035] 实施例1
[0036] 本实施例所描述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus sp.LY01，保藏于中国典型培养物保藏中心，生物保藏编号为CCTCC No: M 2024187，保藏日期：2024年01月24日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
[0037] 以下从分离、初筛、复筛和鉴定过程对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis对马铃薯疮痂病原菌的拮抗作用进行说明。
[0038] S1、马铃薯拮抗菌株的分离
[0039] 自然界中微生物种类庞大，但不同地域的微生物类型分布存在一定差异，即使是同一微生物物种，不同地域分离得到的菌株也存在差异。本实施例所分离到的拮抗菌株是从成都市金堂县马铃薯大田健康根际土壤中分离得到，样本的采集与微生物的分离培养具有一定随机性。
[0040] 具体地，从马铃薯疮痂病发病大田，采集马铃薯健康根际土壤(HRS)。图1中A为疮痂病发病植株的块茎，B是健康植株的块茎。在疮痂病发病植株周围选取健康植株，并采集根际土壤，用于后续试验步骤。
[0041] 取1g土样放入装有9mL无菌水的试管中混匀，于28℃、200r/min的摇床上充分震荡30min，静置至澄清。
[0042] 在无菌环境中取1mL土壤悬浮液进行10倍梯度稀释，分别吸取100μL各稀释梯度的土壤稀释液均匀涂布于LB和PDA固体培养基上，28℃分别培养24h或48h。挑取形态不同的单菌落划线纯化培养，重复纯化后得到的单菌落接种于小斜面置于4℃保存备用。
[0043] S2、疮痂病原菌孢子悬浮液的制备
[0044] 将马铃薯疮痂病原菌Streptomyces scabies接种于燕麦OMA固体培养基上，28℃培养14d，使用5mL经过121℃、20min灭菌的无菌水冲洗培养皿上的孢子，并用无菌枪头轻刮孢子，转移至离心管中后以移液器轻轻吹打均匀，得到疮痂病原菌的孢子悬浮液。
[0045] 利用稀释涂布平板计数法确定孢子悬浮液的浓度，并以无菌水将孢子悬浮液稀释5
至2×10CFU/mL，置于4℃冰箱保存备用。
[0046] 马铃薯疮痂病原菌可以是从田间疮痂病发病植株块茎上分离得到，也可以使用实验室保藏的病原菌。本实施例中，采用从田间疮痂病发病植株块茎上分离得到的病原菌。
[0047] S3、拮抗菌的初筛
[0048] 采用纸碟法初筛疮痂链霉菌拮抗菌，吸取100μL步骤S2制备得到的孢子悬浮液均匀涂布于高氏I号固体培养基，在培养基表面放置无菌滤纸片(d＝6mm)备用。
[0049] 将步骤S1分离获得的细菌菌株在无菌条件下接种于液体LB培养基，37℃培养24h。
[0050] 吸取5μL细菌培养液至固体培养基表面的无菌滤纸中央，以LB培养基为空白对照，试验重复3次，置于28℃培养箱中培养，持续观察是否有抑菌圈。
[0051] 经过观察记录，获得抑菌效果较好的菌株B1，参见图2，初期抑菌圈并不明显，到5～7天抑菌圈大小基本固定。在第6天用十字交叉法测量抑菌圈的直径，其培养液抑菌圈直径达到29.01+0.43mm。
[0052] S4、拮抗菌的复筛
[0053] 采用纸碟法对B1菌株进行复筛。在涂布有100μL疮痂链霉菌孢子悬浮液的高氏I号固体培养基上放置4个滤纸片(d＝6mm)。
[0054] 初筛得到的B1菌株在无菌条件下接种于液体LB培养基，于37℃、200r/min培养24h，得到培养液。
[0055] 取1mL培养液8000r/min离心10min，上清液经0.22μm的滤膜过滤除菌，获得除菌上清液。
[0056] 沉淀菌体用1mL液体LB培养基重悬，得到菌体重悬液。
[0057] 分别吸取5μL菌株B1(OD600＝1)的培养液、除菌上清液、菌体重悬液于不同滤纸片上，以空白LB培养基为对照，置于28℃培养箱中培养6d观察抑菌圈，参见图3，用十字交叉法测量抑菌圈的直径。图3中，左图示出了右图CK、菌体、发酵液和上清液添加区域。
[0058] 3次重复实验结果显示菌体、发酵液和除菌上清液的抑菌圈直径分别为30.65+0.25mm、30.06+0.62mm和24.22+0.65mm，证明B1的菌体、发酵液和除菌上清液均具有较好的疮痂链霉菌抑菌效果。
[0059] S5、拮抗菌的形态鉴定
[0060] 取拮抗菌B1在LB固体培养基上划线，37℃培养箱倒置过夜培养，培养24h时菌落形态呈圆形，颜色为乳白色不透明，无色素产生，培养48h后菌落干燥有隆起和褶皱，参见图4中A图。
[0061] 通过革兰氏染色结果显示拮抗菌B1呈杆状且为革兰氏阳性，参见图4中B图。
[0062] S6、菌种鉴定
[0063] 上述对马铃薯疮痂病拮抗菌B1于LB液体培养基中培养，并送测序公司进行16S rDNA扩增。扩增引物对如Seq ID NO.1～2所示：
[0064] 上游上游引物27F：5’‑GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’，
[0065] 下游引物1492R：5’‑TACGGCTACCTTGTTACGAC‑3’。
[0066] 扩增产物序列如序列表Seq ID NO.3所示。
[0067] 将该序列提交NCBI进行BlastN序列相似性比对。结果显示该微生物菌株的16S序列与多个Bacillus属的微生物具有100％的序列相似度，参见图5和图6，可确定B1菌株属芽孢杆菌属成员，具体为枯草芽孢杆菌。
[0068] S7、菌株保藏
[0069] 该菌株以送至中国典型培养物保藏中心保藏，生物保藏编号为CCTCC NO:M 2024187，保藏日期：2024年01月24日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
[0070] 实施例2
[0071] 实施例1中的抑菌实验表明，所述菌株B1可以在防治马铃薯疮痂病中应用。具体地，将菌株B1的培养液、除菌上清液或菌体作为有效组分，并使用可接受的微生物杀菌剂载体制备为微生物菌剂，用于防治马铃薯疮痂病。
[0072] 可选择性地，微生物杀菌剂载体包括：
[0073] 有机质：有机质是一种重要的微生物杀菌剂载体，可以为微生物提供营养物质。有机质包括动植物残体、堆肥、有机肥料等，这些物质可以改善土壤结构，增加土壤通气性和保水性，有利于微生物的生长和繁殖。
[0074] 矿物肥料：矿物肥料如钾长石、硅酸盐等可以作为微生物杀菌剂的载体。这些矿物肥料可以为微生物提供矿物营养，同时具有吸附和缓释作用，有利于微生物在土壤中的存活和繁殖。
[0075] 粘土矿物：粘土矿物如蒙脱土、高岭土等具有良好的吸附性和膨胀性，可以作为微生物杀菌剂的载体。粘土矿物可以吸附微生物，保护微生物不受损伤，同时可以改善土壤结构，增加土壤通气性和保水性。
[0076] 多糖类物质：多糖类物质如纤维素、半纤维素、木质素等可以作为微生物杀菌剂的载体。这些多糖类物质可以为微生物提供营养物质，同时具有吸附和保湿作用，有利于微生物在土壤中的存活和繁殖。
[0077] 生物炭：生物炭是一种由有机物在缺氧条件下高温热解产生的多孔物质。生物炭具有良好的吸附性和稳定性，可以作为微生物杀菌剂的载体。生物炭可以吸附微生物，保护微生物不受损伤，同时可以改善土壤结构，增加土壤通气性和保水性。
[0078] 在不影响菌株B1活性的前提下，即不与菌株B1互补拮抗的条件下，还可以与其他菌株混合应用。
[0079] 使用含有菌株B1的微生物菌剂防治马铃薯疮痂病时，可将微生物菌剂作为马铃薯种块处理剂处理马铃薯种块，也可将微生物菌剂喷施在马铃薯种植大田中，也可直接将微生物菌剂施入种植窝中，亦可将菌株B1混合在有机肥中，在施有机肥的同时施入菌株B1。
[0080] 菌株B1的培养液、除菌上清液或菌体的有效施入量根据大田中马铃薯疮痂病发生情况来确定。
[0081] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
