[0001] 本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株芽孢杆菌及其应用。

[0002] 水体富营养化已成为困扰世界各国的普遍性环境问题。浮游藻类的大量繁殖导致水华的频繁爆发，严重影响了人类的生活、生产和身体健康，造成了世界范围内的生态灾害，因此，探索控制水华发生的有效途径已迫在眉睫。目前，治理水体富营养化主要是采用物理和化学方法，但这两种方法不仅会消耗大量的财力和物力，而且会在一定程度上破坏生态环境。溶藻菌作为水华和赤潮的防治生物，日益受到国内外环境工作者的广泛关注。国外对溶藻菌的研究已有数十年的历史，自Geitler报道一种寄生在刚毛藻上的粘细菌以来，陆续有溶藻菌的相关报道，研究重点也逐渐从单一溶藻菌的筛选及溶藻特性研究过渡到菌---藻种群生态学及分子调控机理等方面。目前，国内对溶藻细菌的研究还处于初始阶段，因此，寻找高效溶藻菌对溶藻菌的深入研究及应用具有重要意义。

[0003] 水华鱼腥藻是导致水体富营养化的主要藻种之一，其分布广，能够产生藻毒素，直接和间接危害人类，然截止目前，利用微生物方式控制水华鱼腥藻的研究甚是罕见。

[0016] 以下举例说明本发明，但是并不用于限定本发明的保护范围。

[0017] 实施例1芽孢杆菌SSAL-1的分离、纯化及其鉴定

[0018] 1）、芽孢杆菌SSAL-1的分离及纯化

[0019] 以农业部都市农业（南方）重点实验室黄化的水华鱼腥藻液作为溶藻细菌的分离源，采用涂布平板法及分区划线法多次纯化分离，将分离获得的25株细菌分别置于100mL -1LB液体培养基中，于180r·min ，37℃下培养24h，然后分别取800μL滴加到水华鱼腥藻固体平板上，通过溶藻斑的大小考察、比较各菌的溶藻效果，最终筛选出具高溶藻效应的菌株SSAL-1，其在显微镜下的结构如图1所示。经鉴定为芽孢杆菌，命名为SSAL-1，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus）。将其接入斜面培养基，于冰箱4℃保存；将扩大培养制成的菌悬液加入到灭菌的甘油中，甘油的最终浓度为25%，放入-80℃的冰箱保藏。

[0020] 其中，上述的LB液体培养基组分及配比为：酵母提取物，5g；胰蛋白胨，10g；NaCl，10g；蒸馏水1000mL；LB液体培养基的pH值为7.0-7.2。上述的水华鱼腥藻固体培养基组分及配比为：磷酸氢二钾(K2HPO4)，0.075g；硫酸镁(MgSO4·H2O)，0.125g；碳酸钙(CaCO3)，
0.100g；柠檬酸铁(1%水溶液)，0.5mL；柠檬酸(1%水溶液)，0.5mL；钼酸(1%水溶液)，5滴；氢氧化钠(1%水溶液)，1.5mL；琼脂粉，15g；蒸馏水，1000mL。

[0021] 2）、芽孢杆菌SSAL-1的生理生化鉴定

[0022] 经鉴定可知该菌株为革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状，芽孢为椭圆形，大多中央生菌落呈近白色。

[0023] 使 用 引 物 7 f( 5'- CA GAG TT TGA TC CTG GC T-3 ') 和1540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')构筑得到SSAL-1菌株的DNA序列，该序列具有序列表中序列1的核苷酸序列。经序列比对表明，经鉴定为芽孢杆菌，命名为SSAL-1，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus）。该芽孢杆菌SSAL-1已于2012年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保存号为CGMCCNo.6194。

[0024] 实施例2芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻生长效应和光合色素的影响

[0025] 1）、芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻生长效应的影响

[0026] 水华鱼腥藻培养参照藻类生长抑制实验的标准方法（国家环保部），采用水生111号无氮培养液培养，pH为7.5。培养温度30±2℃，连续24h光照，光照强度3000±200lx，静置培养，每天定期摇动3次。

[0027] 在水华鱼腥藻浓度为5×104~1×105个/mL时，分别向100mL藻液中加入芽孢杆9
菌SSAL-1（菌体浓度约为10 个/mL），处理浓度(v/v)梯度为：5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，每组样设3个重复。制备与实验组相同的一系列不同配比的培养液（LB培养液：水生111号无氮培养液），分别用于培养溶藻菌和水华鱼腥藻形成对照组。以细胞计数法测定藻体细胞数量、并测定水华鱼腥藻干重。细胞计数方法：从接种计时起，每隔24h取样，用计数框进行细胞计数。用移液器取经过超声波破碎仪打碎过的藻液0.1mL于计数框中，在低倍镜下观察，放大倍数40×10，随机取五个视野，数出所看到的细胞数，取其平均值。
N=10×a×S计/S视；a--每个视野内细胞平均值；S计--计数框面积；S视--视野面积；N--每mL中细胞个数。水华鱼腥藻干重测定方法：取定量的藻液，离心得藻，加入称量皿，在80℃烘至恒重。

[0028] 不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻的细胞数的影响的测定结果如图2所示，结果表明：水华鱼腥藻细胞的去除效果与芽孢杆菌SSAL-1的浓度呈现出一定的浓度---相关性，即随着芽孢杆菌SSAL-1浓度的增长，对水华鱼腥藻细胞的去除作用越强。当芽孢杆菌SSAL-1菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养24h对水华鱼腥藻细胞的去除率分别为57%、65%、81%、86%、87%、89%和90%，培养168h后分别变为86%、86%、
89%、91%、91%、92%和92%，与对照相比，呈现显著差异（P<0.05）。

[0029] 不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻的干重的影响的测定结果如图3所示，结果表明：纯LB液体培养基的投入对水华鱼腥藻干重亦会产生影响，当LB液体培养基浓度依次为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%时，培养24h后的水华鱼腥藻干重相应增加，分别为7.25、9.09、10.69、11.16、12.53、13.38和13.84mg/mL，而投加不同浓度（5%~35%）的芽孢杆菌SSAL-1后，分别为2.97、3.27、2.24、1.79、1.34和1.52mg/mL。通过排除LB液体培养基本身对水华鱼腥藻生长的影响因素，可见，随着菌体浓度从5%依次升至35%，芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻干重的抑制率依次为59%、64%、79%、84%、86%、90%和89%。

[0030] 2）、芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻光合色素的影响

[0031] 以Bhandari and Sharma法连续扫描400~750nm波长范围内色素吸收光谱，并对水华鱼腥藻叶绿素a含量进行测定。叶绿素a的提取测定：取水华鱼腥藻藻液10mL过0.45μm的混合纤维素膜，将带藻细胞的膜冷冻过夜，取出后迅速用8mL热乙醇于热水浴中萃取2min，将萃取液超声破碎5-20min后，于暗处静置2-6h，离心(5000r/min,4℃)5min后取上清液3.5mL置于比色皿中，于665nm和750nm处测吸光值，计算酸化前的光密度值（E665b＝Abs665b-Abs750b），然后滴加200μL的1mol/L盐酸酸化，5min后于波长665nm和750nm处再测吸光值，计算酸化后的光密度值（E665a＝Abs665a-Abs750a）。采用热乙醇为萃取溶剂，A=11.5，K=2.43，比色皿光程为1cm

[0032]

[0033] 其中，v表示提取液体积(mL)，V表示样品的体积(L)。

[0034] 不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻色素吸收光谱的影响的测定结果如图4所示，结果表明：不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1作用于水华鱼腥藻时，其色素光谱吸收曲线变化表现出一致性。在5%~35%浓度芽孢杆菌SSAL-1菌株处理下，各光谱吸收曲线已非常不明显，各处峰值模糊甚微，表明芽孢杆菌SSAL-1大大地抑制了藻体色素的种类和含量。

[0035] 叶绿素a是光能的捕获者，也是叶绿体膜内光传导者，因此叶绿素a含量的多少，充分反映出藻体光合成能力的强弱。不同浓度的芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻叶绿素a的影响的测定结果如图5所示（A、B、C、D、E、F、G、H分别代表溶藻菌浓度为0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%），结果表明：芽孢杆菌SSAL-1对叶绿素a的抑制作用随着菌体浓度的增加而增强。菌体浓度为5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，对芽孢杆菌SSAL-1而言，24h对叶绿素a的抑制率分别为61%、68%、82%、88%、89%、90%和91%，168h后依次升至92%、94%、94%、
94%、94%、95%和96%。

[0036] 本发明的芽孢杆菌SSAL-1能够有效地降解水华鱼腥藻，对水体富营养化的控制提供了科学依据，为微生物治理水华的研究提供了重要基础。在一定条件下，芽孢杆菌SSAL-1对水华鱼腥藻的降解效果随菌株浓度的增大而增加，当芽孢杆菌SSAL-1的浓度为35%时，对水华鱼腥藻叶绿素a的抑制率可高达96%。

[0037] 以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。

[0038] 序列表

[0039] <110>上海交通大学

[0040] <120>一株芽孢杆菌及其应用

[0041] <160>1

[0042] <170>PatentIn version3.5

[0043] <210>1

[0044] <211>1572

[0045] <212>DNA

[0046] <213>芽孢杆菌（Bacillus）SSAL-1

[0047] <400>1

[0048] cagagtttga tcctggctga tcctggctca gagtttgatc ctggctcagg atgaacgctg 60[0049] gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg aatggattaa gagcttgctc ttatgaagtt 120[0050] agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat aagactggga taactccggg 180[0051] aaaccggggc taataccgga taacattttg aaccgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct 240[0052] tcggctgtca cttatggatg gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 300[0053] ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 360[0054] ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 420[0055] ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag 480[0056] aacaagtgct agttgaataa gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 540[0057] actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc 600[0058] gtaaagcgcg cgcaggtggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 660[0059] gggtcattgg aaactgggag acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc 720[0060] ggtgaaatgc gtagagatat ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa 780[0061] ctgacactga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 840[0062] ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc 900[0063] attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg 960[0064] gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaggaa ccttaccagg 1020[0065] tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggcttctcc ttcgggagca gagtgacagg 1080[0066] tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1140[0067] caacccttga tcttagttgc catcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1200[0068] aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1260[0069] cgtgctacaa tggacggtac aaagagctgc aagaccgcga ggtggagcta atctcataaa 1320[0070] accgttctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga atcgctagta 1380[0071] atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1440[0072] accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tggggtaacc tttttggagc cagccgccta 1500[0073] aggtgggaca gatgattggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtatcgga aggtgcggct 1560[0074] ggatcacctc ct 1572