[0001] 本发明涉及一种新型漆酶。

[0002] 漆酶是属于多铜氧化酶的酶，催化将底物氧化、利用剩余的电子将氧进行4电子还原而生成水的反应。作为漆酶的氧化对象底物，除了典型地举出二苯酚以外，还可举出经甲氧基取代的苯酚和二胺等。这样的催化能力能够应用于各种化学反应，因此期待能够在许多产业界利用。已知漆酶存在于微生物、植物、动物中。

[0003] 例如，专利文献1中记载了来自变色栓菌TV‑1株的热稳定性漆酶，记载了在pH2下呈现最佳的漆酶活性。

[0004] 专利文献2记载了来自灰葡萄孢、变色栓菌或其他微生物源的漆酶、以及可从商业销售源购入的漆酶和/或使用重组技术生成的漆酶呈现活性的pH范围为pH3～pH7。

[0005] 专利文献3中记载了来自属于链霉菌属的微生物的漆酶的最适pH为约4.5，在pH6.5时活性消失。现有技术文献
专利文献

[0006] 专利文献1：国际公开第98/55628号专利文献2：日本特开2001‑103989号公报
专利文献3：日本特开2002‑171968号公报

[0013] 在本说明书中，“非极性氨基酸”包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。“非电荷氨基酸”包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。“酸性氨基酸”包含天冬氨酸和谷氨酸。“碱性氨基酸”包含赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

[0014] 1.漆酶本发明的漆酶包含下述(a)～(c)中任一项所示的多肽。

[0015] (a)多肽，其包含序列号1所示的氨基酸序列；(b)多肽，其包含在序列号1所示的氨基酸序列中替换、添加、插入或缺失1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列，且在包含碱性区域的pH区域中具有与所述(a)所示的多肽同等的漆酶活性；
(c)多肽，其包含相对于序列号1所示的氨基酸序列的序列一致性为70％以上的氨
基酸序列，且在包含碱性区域的pH区域具有与所述(a)所示的多肽同等的漆酶活性。
以下，对包含(a)～(c)的多肽的漆酶进行详述。

[0016] 序列号1是来自Paramyrothecium sp.的漆酶的氨基酸序列。

[0017] (b)和(c)的多肽是以(a)的多肽的氨基酸序列为基本骨架的序列类似的漆酶。

[0018] 关于导入所述(b)的多肽的氨基酸的改变，可以仅包含替换、添加、插入和缺失中的1种改变(例如替换)，也可以包含2种以上的改变(例如替换和插入)。所述(b)的多肽中，替换、添加、插入或缺失的氨基酸为1个或多个或数个即可，例如可列举出1～10个、优选1～8个、1～6个、1～5个、或1～4个、进一步优选1～3个、特别优选1或2个或者1个。

[0019] 另外，所述(c)的多肽中，序列一致性只要为70％以上即可，可举出优选为80％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步优选为98％以上，更进一步优选为99％以上，特别优选为99.5％以上，最优选为99.8％以上。

[0020] 此处，所述(c)的多肽中，例如相对于序列号1所示的氨基酸序列的序列一致性是指与序列号1所示的氨基酸序列进行比较而算出的序列一致性。另外，“序列一致性”是指根据BLAST PACKAGE[sgi32 bit edition，Version 2.0.12；available from National Center for Biotechnology Information(NCBI)]的bl2seq program(Tatiana A.Tatsusova,Thomas L.Madden,FEMS Microbiol.Lett.，Vol.174，p247‑250，1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数设定为Gap insertion Cost value：11、Gap extension Cost value：1即可。

[0021] 在所述(b)和(c)的多肽中，认为序列号1所示的氨基酸序列中的第126位、第128位、第166位、第168位、第429位、第432位、第434位、第484位、第485位、第486位、第490位、第495位的氨基酸有助于活性，因此优选在这些部位不导入替换或缺失。

[0022] 在所述(b)和(c)的多肽中导入氨基酸替换的情况下，作为氨基酸替换的方式，可举出保守性替换。即，在(b)和(c)的多肽中，作为对序列号1所示的氨基酸序列导入的氨基酸替换，例如可举出：如果替换前的氨基酸为非极性氨基酸，则替换为其他的非极性氨基酸；如果替换前的氨基酸为非带电性氨基酸，则替换为其他的非带电性氨基酸；如果替换前的氨基酸为酸性氨基酸，则替换为其他的酸性氨基酸；以及如果替换前的氨基酸为碱性氨基酸，则替换为其他的碱性氨基酸。

[0023] 在所述(b)和(c)的多肽中导入氨基酸添加的情况下，作为氨基酸添加的方式，例如可举出：在N末端的蛋氨酸残基的添加、纯化用标签(例如，寡聚组氨酸等的结合性寡肽)的添加等。

[0024] 所述(b)和(c)的多肽中不仅包含人为变异而得到的多肽，还包含通过基于多肽来源的生物的个体差异或物种的差异的、天然产生的变异(突变体或变体)而产生的多肽。

[0025] 关于所述(b)和(c)的多肽，“碱性区域”是指pH大于8.5、优选pH9以上的区域。

[0026] 另外，在本发明中，“漆酶活性”是指至少在以蛋白质为底物时催化生成交联蛋白质的反应的活性(即，蛋白质交联活性)。具体而言，蛋白质交联活性如下测定。

[0027] 将蛋白质材料以成为15％(w/v)的方式悬浮混合于碱性区域pH的缓冲液中，进行离心分离，由此得到上清作为蛋白质溶液。将该蛋白质溶液100μl、碱性区域pH的缓冲液97μl和200mM的DL‑儿茶素(作为介体)3μl混合，由此得到底物溶液。混合该底物溶液20μ1和酶10μl(以漆酶的浓度以蛋白质浓度计为1.7μg/ml的方式使用。)，在37℃下反应18小时。然后，将反应液稀释10倍，供于SDS‑PAGE。蛋白质交联活性的程度能够用SDS‑PAGE中的高分子蛋白质(即，通过交联而高分子化的蛋白质。表示为原点处的条带)的量进行评价。

[0028] 进而，“具有与(a)所示的多肽同等的漆酶活性”是指在以蛋白质为底物的情况下，通过(b)和(c)的多肽的作用而产生的交联蛋白质的量为(a)的多肽所产生的交联蛋白质的量的80～120％。

[0029] 2.DNA编码本发明的漆酶的DNA(以下，有时也记载为“本发明的DNA”)只要是本领域技术人员，就可以按照本发明的漆酶的氨基酸序列适当制备和设计。

[0030] 2‑1.DNA的设计对于编码本发明的漆酶的DNA的碱基序列，只要是本领域技术人员，就可以按照本发明的漆酶中所述的氨基酸序列适当设计。

[0031] 具体而言，作为编码本发明的漆酶的DNA的例子，可举出以下的(i)～(iii)中任一项所示的DNA。

[0032] (i)包含序列号2所示的碱基序列的DNA；(ii)包含在严格条件下与包含与序列号2所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA
杂交的DNA的碱基序列的DNA；
(iii)包含相对于序列号2所示的碱基序列具有70％以上的同源性的碱基序列的
DNA。
以下，对(i)～(iii)的DNA进行详述。

[0033] 序列号2所示的碱基序列是编码序列号1所示的氨基酸序列的碱基序列。

[0034] (ii)和(iii)的DNA是以(i)的DNA的碱基序列为基本骨架的序列类似的DNA。

[0035] 在所述(ii)的DNA中，“严格条件”是指，在包含0.5％SDS、5×Denhartz’s〔Denhartz’s、0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％聚蔗糖400〕以及100μg/ml鲑鱼精子DNA的6×SSC(1×SSC为0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)中，在50℃～65℃下保温4小时～一夜的条件。

[0036] 具体通过以下方法进行在严格条件下的杂交。即，制成将DNA文库或cDNA文库固定化而成的尼龙膜，在包含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhartz’s、100μg/ml鲑鱼精子DNA的预杂32
交溶液中，在65℃下封闭尼龙膜。然后，加入用 P标记的各探针，在65℃下保温一夜。将该尼龙膜在6×SSC中、室温下清洗10分钟，在包含0.1％SDS的2×SSC中、室温下清洗10分钟，在包含0.1％SDS的0.2×SSC中、45℃下清洗30分钟后，采取放射自显影术，能够检测出与探针特异性杂交的DNA。

[0037] 所述(iii)的DNA中，上述同源性为70％以上即可，可举出：优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、更进一步优选98％以上、再更进一步优选99％以上、特别优选99.5％以上、最优选99.8％以上。

[0038] 此处，碱基序列的“同源性”是指根据BLAST PACKAGE[sgi32 bit edition，Version 2.0.12；available from the National Center for Biotechnology Information(NCBI)]的b12seq program(Tatiana A.Tatsusova，Thomas L.Madden，FEMS Microbiol.Lett.，Vol.174，p247‑250，1999)得到的一致性的值。参数设定为Gap insertion Cost value：11、Gap extension Cost value：1即可。

[0039] 所述(ii)和(iii)的DNA中，可以在所述(i)的DNA中进一步添加编码纯化用标签(例如，寡聚组氨酸等结合性寡肽)的碱基序列的至少任一者。

[0040] 2‑2.DNA的制备本发明的DNA例如可以通过以编码所述(a)～(c)中任一多肽的DNA为模板，利用
PCR等取得至少编码所述(a)～(c)中任一多肽的区域而得到。另外，编码本发明的漆酶的DNA也可以通过基因的合成法人工合成。

[0041] 另外，在碱基序列的特定的部位中导入特定突变的情况下，突变导入方法是公知的，例如可利用DNA的部位特异性突变导入法等。作为变换DNA中的碱基的具体的方法，例如也可使用市售的试剂盒而进行。

[0042] 在碱基序列中导入了突变的DNA可使用DNA测序仪确认碱基序列。一旦确定碱基序列，之后通过以化学合成、克隆的探针作为模板的PCR、或以具有该碱基序列的DNA片段作为探针的杂交，可以得到编码所述漆酶的DNA。

[0043] 另外，也可以通过定点诱变法等合成作为编码所述漆酶的DNA的突变型的、与突变前具有同等功能的DNA。应予说明，在编码所述漆酶的DNA中导入突变时，可以通过Kunkel法、Gapped duplex法、Mega‑primer PCR法等公知的方法进行。

[0044] 本发明的DNA优选为使密码子利用频率在宿主中最适化的DNA。例如，如果是使用大肠杆菌作为宿主的情况，则优选为使密码子利用频率在大肠杆菌中最适化的DNA。

[0045] 3.表达盒或重组载体包含编码本发明的漆酶的DNA的表达盒或重组载体(以下也记为“本发明的表达
盒”或“本发明的重组载体”)包含编码本发明的漆酶的DNA。本发明的表达盒或重组载体可以通过在本发明的DNA中连接启动子和终止子、或者通过在表达载体中插入本发明的表达盒或本发明的DNA而得到。

[0046] 本发明的表达盒或重组载体中，作为控制因子，除了启动子和终止子以外，还可以根据需要包含增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等转录要素。这些控制因子只要可工作地连接于本发明的DNA即可。可工作地连接是指，调节本发明的DNA的各种控制因子和本发明的DNA以能够在宿主细胞中工作的状态连接。另外，本发明的表达盒或重组载体还可以构成为包含蛋白酶识别序列和N末端序列和/或C末端序列。

[0047] 作为表达载体，优选由在宿主内可自律性增殖的噬菌体、质粒、或病毒作为基因重组用途而构建的表达载体。这样的表达载体是公知的，本领域技术人员可以适当选择使用与宿主细胞的适当组合。例如，在将微生物作为宿主的情况下，可举出：pBluescript(pBS)II SK(‑)(Stratagene公司制造)、pSTV系载体(Takara Bio公司制造)、pUC系载体(Takara Bio公司制造)、pET系载体(Merck公司制造)、pGEX系载体(GEHealthcare公司制造)、pCold系载体(Takara Bio公司制造)、pHY300PLK(Takara Bio公司制造)、pUB110(Mckenzie，T.et al.，1986，Plasmid 15(2)，p.93‑103)、pBR322(TakaraBio公司制造)、pRS403(Stratagene公司制造)和pMW218/219(NipponGene公司制造)等。在将藻类或微细藻类作为宿主的情况下，可举出：pUC19(TakaraBio公司制造)、P66(Chlamydomonas Center)、P‑322(Chlamydomonas Center)、pPha‑T1(参照Yangmin Gong，et al.，Journal of Basic Microbiology,2011，vol.51，p.666‑672)、或pJET1(Cosmo Bio公司制造)等。在将植物细胞作为宿主的情况下，可举出：pRI系载体(TakaraBio公司制造)、pBI系载体(Clontec公司制造)和IN3系载体(Inplanta innovations公司制造)。

[0048] 4.转化体通过使用本发明的表达盒或重组载体转化宿主，可以得到转化体(以下有时也表
述为“本发明的转化体”)。

[0049] 作为转化体的制造中使用的宿主，只要能够导入基因、且能够自主增殖、能够表达本发明的基因的性状，就没有特别限制，作为优选的示例，例如可举出：属于大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等假单胞菌属等的细菌，放线菌等，酵母等，丝状菌等微生物；此外，也可以为动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。其中，特别优选大肠杆菌。

[0050] 作为转化体的制造中使用的宿主，可以是作为本发明的漆酶的来源菌或来源细胞的Paramyrothecium sp.。

[0051] 本发明的转化体可以通过在宿主中导入本发明的表达盒或重组载体而得到。导入本发明的DNA的部位只要能够表达目标基因，就没有特别限定，可以在质粒上，也可以在基因组上。作为导入本发明的表达盒或本发明的重组载体的具体方法，例如可举出：重组载体法、基因组编辑法。

[0052] 将本发明的表达盒或重组载体导入宿主的条件根据宿主的种类等适当设定即可。在宿主为微生物的情况下，例如可举出：使用基于钙离子处理的感受态细胞的方法、电穿孔法、原生质球法和醋酸锂法等。如果是宿主为动物细胞的情况，则例如可举出：电穿孔法、磷酸钙法和脂质转染法等。如果是宿主为昆虫细胞的情况，则例如可举出：磷酸钙法、脂质转染法和电穿孔法等。如果是宿主为植物细胞的情况，则例如可举出：电穿孔法、农杆菌法、基因枪法、以及PEG法等。

[0053] 5.漆酶的制造方法本发明的漆酶可以通过培养所述本发明的转化体来制造。另外，本发明的漆酶也
可以通过培养Paramyrothecium sp.本身(未转化者)来制造。

[0054] 本发明的转化体或者来源菌或来源细胞的培养条件只要考虑宿主或者来源菌或来源细胞的营养生理性质而适当设定即可，优选举出液体培养。另外，如果是进行工业制造的情况，则优选通气搅拌培养。

[0055] 培养本发明的转化体或者来源菌或来源细胞，通过离心分离培养液等方法回收培养上清或者培养菌体或培养细胞。如果是本发明的漆酶蓄积在培养菌体内或培养细胞内的情况，则将菌体或细胞利用超声波、弗氏压碎器等机械方法或溶菌酶等溶解菌体的酶实施处理，根据需要通过使用蛋白酶等酶或十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂而进行可溶化，可以得到包含本发明的漆酶的水溶性级分。

[0056] 另外，也可以通过选择适当的表达载体和宿主，使表达的本发明的漆酶分泌到培养液中。

[0057] 如上所述那样得到的包含本发明的漆酶的培养液、水溶性级分、或蛋白酶处理物可以直接供于纯化处理，也可以将该培养液、水溶性级分或蛋白酶处理物中的本发明的漆酶浓缩后供于纯化处理。

[0058] 浓缩例如可通过减压浓缩、膜浓缩、盐析处理、基于亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇和丙酮)的分级沉淀法等而进行。

[0059] 本发明的漆酶的纯化处理例如可以通过适当组合凝胶过滤、疏水性色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等方法来进行。

[0060] 如此纯化的本发明的漆酶可以根据需要通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等进行粉末化。

[0061] 6.酶制剂本发明的漆酶可以以酶制剂的形态提供。因此，本发明还提供包含上述本发明的
漆酶的酶制剂。

[0062] 作为本发明的酶制剂中的上述本发明的漆酶的含量，没有特别限定，可以在发挥漆酶活性的范围内适当设定。

[0063] 本发明的酶制剂除了上述本发明的漆酶以外，还可以在不影响本发明的效果的程度下含有其他成分。作为其他成分，可举出上述本发明的漆酶以外的其他酶、介体、添加剂、上述制造方法中产生的培养残渣等。

[0064] 作为其他酶，可以根据其用途适当确定，例如可举出：淀粉酶(α‑淀粉酶、β‑淀粉酶、葡糖淀粉酶)、葡糖苷酶(α‑葡糖苷酶、β‑葡糖苷酶)、半乳糖苷酶(α‑半乳糖苷酶、β‑半乳糖苷酶)、蛋白酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)、肽酶(亮氨酸肽酶、氨基肽酶)、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、磷酸酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶)、核酸酶、脱氨酶、氧化酶、脱氢酶(不包括上述有效成分)、谷氨酰胺酶、果胶酶、过氧化氢酶、葡聚糖酶、谷氨酰胺转胺酶、蛋白质脱酰胺酶、普鲁兰酶等。这些其他酶可以单独包含1种，也可以包含多种的组合。

[0065] 作为介体，例如可举出：3‑(3，4‑二羟基苯基)丙氨酸(DOPA)、儿茶素和咖啡因等。这些介体可以单独包含1种，也可以包含多种的组合。

[0066] 作为添加剂，可以根据上述本发明的漆酶的用途和酶制剂的制剂形态适当确定，可举出：赋形剂、缓冲剂、悬浊剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可举出：淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D‑葡萄糖、山梨糖醇、D‑甘露糖醇、白糖、甘油、果胶等。作为缓冲剂，可举出：磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为稳定剂，可举出：丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可举出：苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可举出：乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。这些添加剂可以单独包含1种，也可以以多种的组合包含。

[0067] 作为培养残渣，可举出：来自培养基的成分、杂质蛋白质、菌体成分、细胞成分等。

[0068] 作为本发明的酶制剂的制剂形态，没有特别限定，例如可举出：液状、固体状(粉末、颗粒等)等。这些制剂形态的酶制剂可以通过通常公知的方法制备。

[0069] 本发明的酶制剂具体而言可以用作蛋白质的交联剂，另外，也可以用作饮食品或饮食品用原材料、产业用原材料或产业废弃成分、或者医药或科学分析用原材料的氧化改性剂。关于氧化改性的对象和氧化改性的详细情况，如后述的“7.漆酶的用途”中所述。

[0070] 7.漆酶的用途本发明的漆酶可以用于利用底物的氧化反应和/或由该氧化反应生成的反应中间
体的自由基种引起的多种附带化学反应的任意用途。作为这样的氧化反应或附带化学反应的例子，可举出：邻‑对‑二苯酚、漆酚、虫漆酚等酚性化合物的氧化；对苯二胺等芳香族胺的氧化；木质素的分解；具有酪氨酸侧链(酚羟基)、半胱氨酸侧链(巯基)、赖氨酸侧链(ε‑氨基)、组氨酸侧链(咪唑基)等容易被氧化的官能团的蛋白质的交联等。在本说明书中，也将通过这样的漆酶的氧化反应和附带化学反应使底物发生化学变化的情况记载为“氧化改性”。

[0071] 7‑1.交联蛋白质的制造方法上述氧化改性的方式中，特别优选举出通过蛋白质的交联而变化。因此，本发明还提供一种交联蛋白质的制造方法，其包括使上述本发明的漆酶作用于蛋白质的工序。

[0072] 在本发明的交联蛋白质的制造方法中，从进一步提高反应效率的观点出发，在该工序中，优选将3‑(3，4‑二羟基苯基)丙氨酸(DOPA)、儿茶素和咖啡因等介体与漆酶并用。这些介体可以单独包含1种，也可以包含多种的组合。

[0073] 在本发明的交联蛋白质的制造方法中，关于漆酶与蛋白质的反应条件(例如，酶量、反应时间、反应pH、反应温度等)，只要蛋白质交联达到所期望的程度，就没有特别限制，本领域技术人员可以根据本发明的漆酶的种类和/或浓度、蛋白质的种类和/或浓度、以及/或者所期望的蛋白质交联的程度等适当设定。

[0074] 本发明的交联蛋白质的制造方法中使用的漆酶至少在碱性区域呈现优异的漆酶活性，因此作为反应pH，可举出优选为大于8.5，更优选为9以上。作为该反应pH的上限，例如可以举出：12以下、优选为11以下、更优选为10以下、进一步优选为9.5以下。

[0075] 需要说明的是，本发明的交联蛋白质的制造方法中使用的漆酶优选不仅在碱性区域而且在中性区域也呈现优异的漆酶活性，因此作为反应pH，例如可以为5以上、6以上、7以上、或8以上。作为该反应pH的上限，例如可以举出：12以下、优选为11以下、更优选为10以下、进一步优选为9.5以下、9以下、或8.5以下。

[0076] 另外，作为反应温度的优选例，可举出4～45℃、更优选25～40℃。

[0077] 7‑2.经氧化改性的饮食品或饮食品用原材料、产业用原材料或产业废弃成分、或者医药或科学分析用原材料的制造方法作为上述氧化改性的对象物，可举出：饮食品或饮食品用原材料、产业用原材料或产业废弃成分、或者医药或科学分析用原材料等。因此，本发明还提供一种氧化改性的饮食品或饮食品用原材料、产业用原材料或产业废弃成分、或者医药或科学分析用原材料的制造方法，其包括使上述本发明的漆酶作用于饮食品或饮食品用原材料、产业用原材料或产业废弃成分、或者医药或科学分析用原材料的工序。

[0078] 作为饮食品或饮食品用原材料的氧化改性的例子，可举出：蛋白质的交联、组织状植物性蛋白质的粘结性提高、食品的增稠或凝胶化、红茶的褐变处理、食品的苦涩味的除去等。作为产业用原材料或产业废弃成分的氧化改性的例子，可举出：人工漆的制造、从纸浆中除去木质素、包含毒性强的酚性化合物和/或芳香族胺的废液的无毒化、有机化合物的合成、粘接剂的制造、以及混凝土混合剂的合成等。作为医药或科学分析用原材料的氧化改性的例子，可举出：检查对象成分向能够检测的成分的转换、分析对象蛋白质的交联等。

[0079] 在本发明的经氧化改性的饮食品或饮食品用原材料、产业用原材料或产业废弃成分、或者医药或科学分析用原材料的制造方法中，从进一步提高反应效率的观点出发，优选在该工序中将介体与漆酶并用。关于能够使用的介体的例子，如上述“7‑1.交联蛋白质的制造方法”中所述。

[0080] 在本发明的经氧化改性的饮食品或饮食品用原材料、产业用原材料或产业废弃成分、或者医药或科学分析用原材料的制造方法中，对于漆酶与氧化改性的对象物(即，饮食品或饮食品用原材料、产业用原材料或产业废弃成分、或者医药或科学分析用原材料)的反应条件(例如，酶量、反应时间、反应pH、反应温度等)，只要能够实现所期望的程度的氧化改性，就没有特别限制，本领域技术人员可以根据本发明的漆酶的种类和/或浓度、氧化改性对象的种类和/或浓度、和/或所期望的氧化改性的程度等适当设定。另外，关于反应pH和反应温度的优选例，如上述“7‑1.交联蛋白质的制造方法”中所述。实施例

[0081] 以下，举出实施例具体说明本发明，但本发明不被解释为限定于以下实施例。

[0082] 试验例1：培养和酶纯化(1‑1)培养和过滤
在包含表1所示的漆酶生产培养基100ml的500ml容量振荡烧瓶中，接种利用马铃
薯葡萄糖琼脂培养基在30℃下生长3天的Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株(原产地国：
缅甸)菌落的1cm见方切片，在30℃下往复振荡培养(140r/min)3天。通过离心分离对培养液进行固液分离后，滤出上清液，将回收的滤液作为粗酶液。

[0083] [表1]

[0084] (1‑2)一次纯化(阴离子色谱法)通过超滤将粗酶液浓缩后，对20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)+0.3M NaCl进行透析，得到透析内液。将该透析内液供于用上述缓冲液平衡化的HiTrap Q FastFlow(I.D.×L＝1.6×2.5cm；Cytiva公司制造)。将上述柱用相同缓冲液50ml洗涤后，通过NaCl浓度的线性梯度(0.3～0.6M、50m1)，使吸附于柱的漆酶洗脱，进行分级。对于得到的各级分的一部分，通过以下所示的方法进行漆酶活性的确认(ABTS的氧化和蛋白质的交联)，回收具有两种活性的级分，作为一次纯化液。

[0085] (1‑3)二次纯化(凝胶过滤色谱)通过超滤将一次纯化液浓缩后，对20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)+0.5M NaCl进行透
析，得到透析内液。将该透析内液供于用HiLoad 16/600Superdex 200pg(I.D.×L＝1.6×
60cm；Cytiva公司制造)，合并具有活性的级分，对20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行透析，得到纯化漆酶溶液。用SDS‑PAGE和Native‑PAGE确认纯化。

[0086] <漆酶活性的确认‑ABTS的氧化>将作为底物的ABTS(2,2′‑连氮基‑双(3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸))的50mM溶液20μl、125mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)160μl和酶液20μl添加到微孔板中进行混合，在37℃下进行
15分钟反应，测定反应前后的405nm下的吸光度。通过确认ABTS的氧化，确认漆酶活性的存在。

[0087] <漆酶活性的确认‑蛋白质的交联>对后述表2的三种植物蛋白质粉末分别进行以下的操作。将植物蛋白质粉末以成
为15％(w/v)的方式悬浮于50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中并充分混合后，通过12000×g、5分钟的离心进行固液分离，得到上清液作为蛋白质溶液。将该蛋白质溶液100μl、50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)97μl和200mM的DL‑儿茶素(介体)3μl混合，由此得到底物溶液。混合该底物溶液20μl和酶10μl(以漆酶的浓度以使用DC蛋白测定(Bio‑Rad公司制造)定量的蛋白质浓度计为1.7μg/ml的方式使用。)，在37℃下反应18小时。然后，将反应液稀释10倍，将表2中所示的施加量供于SDS‑PAGE。蛋白质交联活性能够通过SDS‑PAGE中的高分子蛋白质(通过交联而高分子化的蛋白质。表示为原点处的条带)的存在来确认。

[0088] 试验例2：酶性质评价(2‑1)漆酶活性(蛋白质交联活性)的评价
关于由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶和作为比较用的漆酶
的天野酶制品株式会社制造的“漆酶Y120”(也记载为LC‑Y120)，分别对表2所示的三种植物蛋白质在特定的pH(pH3.0、5.0、7.0和9.0)下的蛋白质交联活性进行评价。

[0089] 对表2的三种植物蛋白质粉末分别进行以下的操作。将植物蛋白质粉末以成为15％(w/v)的方式悬浮于特定的pH的缓冲液[50mM的柠檬酸钠缓冲液(pH3.0或5.0)、50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)、或50mM的Tris‑HCl缓冲液(pH9.0)]中并充分混合后，通过1200×g、
5分钟的离心进行固液分离，得到上清作为蛋白质溶液。将该蛋白质溶液100μ1、上述特定的pH的缓冲液97μl和200mM的DL‑儿茶素(介体)3μl混合，由此得到底物溶液。混合该底物溶液
20μl和酶10μl(以漆酶的浓度以使用DC蛋白测定(Bio‑Rad公司制造)定量的蛋白质浓度计为1.7μg/ml的方式使用。)，在37℃下反应18小时。然后，将反应液稀释10倍，将表2中所示的施加量供于SDS‑PAGE。蛋白质交联活性能够用SDS‑PAGE中的交联蛋白质蛋白质(通过交联而高分子化的蛋白质。表示为原点处的条带。)的量以使用比较用漆酶(LC‑Y120)时的量为基准通过目视进行评价。对于确认到该交联蛋白质的存在的情况，以“+”的数量评价交联蛋白质的量的程度。“+”的数量越多，交联蛋白的生成量越多。将结果示于图1～3。需要说明的是，该交联蛋白质的量也可以使用imageJ等图像分析软件进行定量。

[0090] [表2]

[0091] 在图1～图3中，最左侧的泳道(图1、图2中的泳道1、图3中的空白泳道)表示未添加酶的对照的结果，中间的泳道(图1、图2中的泳道2、图3中的“LCY120”的泳道)表示使用了比较用的漆酶的情况下的结果，最右侧的泳道(图1、图2中的泳道3、图3中的“MM2103”的泳道)表示使用了从Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶的情况下的结果。

[0092] 由图1～3可知，对于任一种植物性蛋白质，在使用比较用的漆酶LC‑Y120(图1、图2中的泳道2、图3中的“LCY120”的泳道)的情况下，在碱性区域(pH9)中几乎没有确认到蛋白质交联活性，与此相对，在使用由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的漆酶的情况下(图1、图2中的泳道3、图3中的“MM2103”的泳道)，在碱性区域(pH9)中确认到优异的蛋白质交联活性。另外，由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的漆酶不仅在碱性区域，在pH5～7的区域也显示优异的蛋白质交联活性，因此通用性高。

[0093] (2‑2)介体的蛋白质交联促进效果的评价对于由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的漆酶，除了仅使用50mM的Tris‑HCl缓冲液(pH9.0)、将介体变更为表3中记载的物质(其中，以成为100mM的浓度的方式使用。)、将漆酶的浓度以蛋白质浓度计为33μg/ml的方式使用、以及将反应时间设为1小时之外，与上述“(1‑2)漆酶活性(蛋白质交联活性)的评价方法”进行相同的操作，由此评价基于各种介体的蛋白质交联促进效果。将结果示于图4。在图4中，各泳道的数字与表3中的数字对应。

[0094] [表3]泳道序号 介体
1 没食子酸‑水合物
2 阿魏酸
3 单宁酸
4 香草酸
5 L‑酪氨酸
6 L‑DOPA
7 丁香酚
8 异丁香酚
9 DL‑儿茶素
10 (±)‑柠檬烯
11 L‑苯丙氨酸
12 L‑色氨酸
13 L‑半胱氨酸盐酸盐一水物
14 咖啡酸
15 MilliQ(control.)

[0095] 由图4可知，在使用L‑DOPA、DL‑儿茶素和咖啡酸的情况下，确认到蛋白质交联促进效果。另外，在这些介体中，在使用L‑DOPA和DL‑儿茶素(特别是L‑DOPA)的情况下，蛋白质交联促进效果显著。

[0096] (2‑3)pH稳定性将由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶和比较用漆酶LC‑Y120
分别溶解于pH不同的50mM Britton‑Robinson缓冲液(pH2～12)中，将得到的酶液在4℃下孵育1小时，由此进行pH处理。对各酶液进行与上述(1‑3)的“<漆酶活性的确认‑ABTS的氧化>”同样的操作。将1分钟内催化1μmolABTS氧化的酶活性定义为1单元(U)，测定酶活性值。

[0097] 导出将显示最高残存活性的处理pH下的酶活性值设为100％时的pH处理后的酶活性值的相对值作为残存活性(％)。将结果示于图5。由图5可知，由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的漆酶在碱性区域的稳定性与市售的漆酶LC‑Y120相比显著提高。

[0098] (2‑4)温度稳定性将由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶和比较用的漆酶LC‑
Y120分别溶解于50mM Britton‑Robinson缓冲液(pH 7.0)，将得到的酶液在4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃下孵育1小时，由此进行温度处理。对于温度处理前和处理后的各酶液，与上述(2‑3)中记载的方法同样地测定酶活性值，导出将温度处理前的酶活性值设为100％时的温度处理后的酶活性值的相对值作为残存活性(％)。将结果示于图6。由图6可知，由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的漆酶在低于40℃时显示出高稳定性。

[0099] (2‑5)最适pH分别使用由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶和比较用漆酶
LC‑Y120，使用pH不同的50mM的Britton‑Robinson缓冲液(pH2～12)代替50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，除此以外，进行与上述(1‑3)的“<漆酶活性的确认‑ABTS的氧化>”同样的操作。
将1分钟内催化1μmol的ABTS氧化的酶活性定义为1单元(U)，测定酶活性值。导出将LC‑Y120的最适pH下的酶活性值设为100％时的相对活性值。将结果示于图7。由图7可知，由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的漆酶在碱性区域也呈现活性。

[0100] (2‑6)最适温度使用由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶和比较用漆酶LC‑
Y120，以4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或70℃代替反应温度37℃，使用各漆酶的最适pH即50mM的Britton‑Robinson缓冲液代替50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，除此以外，进行与上述(1‑3)的“<漆酶活性的确认‑ABTS的氧化>”同样的操作。将1分钟内催化1μmol的ABTS氧化的酶活性定义为1单元(U)，测定酶活性值。导出将LC‑Y120的最适温度下的酶活性值设为
100％时的相对活性值。将结果示于图8。

[0101] 试验例3：序列的鉴定进行由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的漆酶的测序。其结果，确定了作为基因序列的序列号3所示的序列(2018bp)、作为编码区域序列的序列号2所示的序列(1764bp)、以及作为氨基酸序列的序列号1所示的序列(587aa)。

[0102] 试验例4：组织状植物性蛋白质的粘结性提高在粒状大豆蛋白(Marukome株式会社制造)中加入5倍重量的温水(40℃)，静置10
分钟使其溶胀。除去水分，称量溶胀的粒状大豆蛋白25g。在溶胀的粒状大豆蛋白中混合
2.75g的粉末状豌豆蛋白(Roquette公司制NUTRALYS F85M)，添加约250U(每1g溶胀粒状大豆蛋白为约10U)由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶，制备大豆蛋白质混合物。将大豆蛋白质混合物充分混合而成型为汉堡状，在25℃下静置60分钟。在烘箱中经过190℃、15分钟的烧制工序，得到肉样加工食品。

[0103] 将得到的肉样加工食品的外观照片示于图9。在图9中，也示出为了进行比较，除了未使用漆酶以外，同样地得到的肉样加工食品(未经酶处理)。如图9所示，在未经酶处理的情况下完全没有粘结，与此相对，在用来自MM13株的漆酶进行处理的情况下能够确认粘结性。

[0104] 试验例5：蛋白质溶液的增稠将试验例2中使用的豌豆蛋白粉末以成为15％(w/v)的方式悬浮于特定的pH的缓
冲液[50mM的柠檬酸钠缓冲液(pH3.0或5.0)、50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)、或50mM的Tris‑HCl缓冲液(pH9.0)]中，将其作为豌豆蛋白悬浮液。在该豌豆蛋白悬浮液中加入以蛋白质重量换算量计为0.1mg/ml的由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶或比较用的漆酶LC‑Y120、和5mg/ml的蛋白质谷氨酰胺酶，在pH为3、5、7、或9的条件下，在37℃下反应
18小时。关于反应物的性状，将物性没有变化的情况评价为“‑”，将确认到增稠的情况评价为“+”。将结果示于表4。

[0105] [表4]  pH3 pH5 pH7 pH9
LC‑Y120 ‑ ‑ ‑ ‑
MM13‑F2103 ‑ ‑ ‑ +

[0106] 如表4所示，利用由Paramyrothecium sp.MM13‑F2103株得到的纯化漆酶，通过在碱性区域进行处理，确认到蛋白质溶液的增稠。