漆酶突变体及其应用 技术领域： [0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及漆酶突变体及编码基因和应用。 背景技术： [0002] 漆酶是一种含四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶，以单体糖蛋白的形式存在。 [0003] 目前已有大量的细菌漆酶基因被克隆出来，如大肠杆菌的CueO、枯草芽孢杆菌的CotA、谷氨酸棒状杆菌的CgL1、丁香假单胞菌的CopA等。同来源于真核生物的漆酶相比，细菌漆酶具有基因克隆方便、热稳定性好、酶活pH值广泛、无糖基化修饰等优点。 [0004] 漆酶因品种不同最适pH值不同、适宜温度不同，也因底物不同而异，但都在酸性pH范围内，不适用于碱性pH范围内使用。漆酶活性部分的氨基酸含有酸性基团和碱性基团，在不同pH值时因解离状态不同，pH对酶活性影响主要有三种情况:酸或碱使酶的空间结构改变，引起酶的活性丧失；酸或碱影响酶的活性部分的解离状态，使得底物不能被分解；酸或碱破坏了底物的解离状态，使底物与酶无法结合。 [0005] 国内对漆酶的应用研究，主要集中在纸浆漂白、染料废水脱色、提升食品品质、降解饲料中的黄曲霉毒素等方面。其工业应用，一般都是在高温及酸碱变换的环境，例如在造纸工业中的煮炼和漂白的环节中，高温和碱性环境的要求；在果汁等饮料的生产中，酸性环境下降解其中的酚类物质，使饮料澄清，以保证饮品品质的稳定；在食品高温烘焙时加入漆酶，可使食品风味好，更筋道；在饲料深加工中，不同pH及高温蒸煮环节中，加入漆酶，以去除黄曲霉毒素。 [0006] 酶在酸碱及高温环境下的稳定性差，导致酶解效果并不理想，发酵酶活水平低，导致应用成本较高，难以在工业上推广应用。因此，现阶段漆酶的工业化应用亟待解决的问题，包括但不限于以下几点：1.耐高温；2.耐酸碱；3.发酵酶活水平高。 发明内容： [0007] 本发明的主要目的是提供一种漆酶突变体及其基因、及含有该基因的重组表达载体和重组菌株、及该重组菌制备漆酶的方法，旨在解决现有技术中漆酶耐酸碱耐热性差、发酵酶活水平低的问题。 [0008] 为实现上述目的，本发明提供的技术方案之一，是一种漆酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示野生型漆酶氨基酸序列中第141、198、341、389和476位点的W、T、R、I、S，分别突变为C、P、S、T、R获得的，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。 [0009] 本发明还提供上述突变体的编码基因； [0010] 进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。 [0011] 本发明提供的技术方案之二，是上述漆酶突变体的应用，特别是在降解真菌毒素中的应用，特别是对黄曲霉毒素的降解；更特别的是在饲料工业中降解黄曲霉毒素的应用。 [0012] 本发明提供的技术方案之三，是包含上述漆酶突变编码基因的重组载体或重组菌株； [0013] 优选地，所述重组载体所采用的表达质粒为pPICZαA； [0014] 优选的，所述重组菌株采用的的宿主细胞为毕赤酵母X33。 [0015] 本发明提供的技术方案之四，是上述重组表达载体或重组菌株的应用，特别是在制备技术方案一所述漆酶突变体中的应用； [0016] 进一步地，采用上述重组菌株制备漆酶突变体的方法如下： [0017] 发酵罐中的培养：按照发酵罐培养基体积的4‑6％进行接种，培养温度28‑30℃，罐 3 3 压0.04‑0.08MPa，初始转速100rpm，初始风量200m/h，最高转速600rpm，最高通风量4000m/h； [0018] 补料的控制：当发酵至菌体湿重达到60‑70g/L时，开始流加30‑40％的甘油，流加速度为600‑700kg/h，当菌体湿重达到150‑160g/L时，停止流加甘油，饥饿处理1‑1.5h，然后开始流加甲醇，前1‑2h，流加甲醇的流速为100‑150kg/h，1‑2h后，甲醇的流加速度每小时增加30‑50kg，直至达到最大补料速率为300‑350kg/h，保持该补料速度直至发酵结束； [0019] 溶氧的控制：开始流加甲醇前，通过调节转速和风量控制溶氧达到30‑40％，开始流加甲醇后，控制溶氧20％‑30％，达到最高转速和通风量后，溶氧不再控制； [0020] 补氨控制pH在4.5‑5.5； [0021] 菌体自溶严重时结束发酵，培养周期180‑200h。 [0022] 进一步地，种子罐中培养条件为：5‑7％接种量，温度28‑30℃，罐压0.04‑0.08Mpa， 3 初始转速100rpm，初始风量20m /h，通过加转速和风量控制溶氧大于30％，最高转速 3 600rpm，最高通风量200m/h，补氨控制pH在4.5‑5.5，培养48‑50h； [0023] 进一步地，种子培养基组成为(w/v)：甘油2‑3％，磷酸一铵4‑6％，磷酸氢二钠0.2‑ 0.5％，硫酸镁2‑2.5％，硫酸钾1‑1.3％，硫酸钙0.1‑0.3％，氢氧化钾0.1‑0.2％，磷酸0.02‑ 0.08％，其余为水，pH在4.5‑5.5； [0024] 进一步地，发酵培养基组成为(w/v)：甘油5‑6％，磷酸一铵6‑7％，磷酸氢二钠0.3‑ 0.5％，硫酸镁2.5‑3.5％，硫酸钾1‑1.6％，硫酸钙0.1‑0.4％，氢氧化钾0.1‑0.2％，磷酸 0.03‑0.1％，其余为水，pH在4.5‑5.5。 [0025] 有益效果： [0026] 本发明提供的漆酶突变体，最适反应pH为4.5，在pH3.0‑9.0的条件下处理24h后，相对酶活力仍然保持在90％以上，最适反应温度为85℃，在40‑80℃条件下保温15h，仍能保留95％以上的酶活。 [0027] 本发明提供的漆酶突变体，通过表达质粒pPICZαA在毕赤酵母X33中进行表达，在 3 60m发酵罐中的平均发酵酶活力为106673U/L，能进一步降低漆酶的生产成本，促进漆酶在降解真菌毒素方面的广泛应用。 [0028] 此外，本发明确认了漆酶中与耐酸碱、耐热性能相关的5个氨基酸位点，并证明了这些位点对于该酶耐酸碱、耐热性能的重要性，对于研究漆酶的耐酸碱、耐热性能提供了重要的线索，同时对于其它漆酶的研究提供了可靠的参考依据。 附图说明： [0029] 图1漆酶突变前后的最适反应pH曲线； [0030] 图2漆酶突变前后的pH稳定性曲线； [0031] 图3漆酶突变前后的最适反应温度曲线； [0032] 图4漆酶突变前后的温度稳定性曲线； [0033] 图5漆酶突变前后在最适反应温度下，对黄曲霉毒素B1降解率的曲线。 具体实施方式： [0034] 以下通过具体实施案例对本发明做详细说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。 [0035] 本发明的漆酶突变体，是通过将野生型漆酶的氨基酸序列进行W141C、T198P、R341S、I389T、S476R点突变而获得，漆酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 [0036] 本发明所采用的漆酶突变体的标识： [0037] 采用“原始氨基酸+位置+替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如W141C，表示位置141的氨基酸由W替换成C，位置的编号对应于SEQ ID NO.1中野生型漆酶的氨基酸序列编号，信息如下表。 [0038] [0039] 具体序列信息如下： [0040] 野生型漆酶的氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示： [0041] MALEKFADELPIIETLQPQKVTMKECFHKLHSAVIGTPDGITWHYEQEGTGATPPDSDGYLH [0042] RDLPPTRLWGYNGLFPGPTIWSGDSMCLHARQACGSRRASIPDKTVVHLDVKTVVHLHGG [0043] KTVVHLHGGNQDENVYIKWMNDLPDKHDDSDGYPEVTPDDSDGYPEHHSESYPNKQRG [0044] ALLWYHDHAMAITHGGVTPGHQEPDVRLKLPSDAWFTKDEYDVPLLITDRTIYNKFGDIV [0045] YTGPAVPPPPSEFKETGPYFEREVYHKPLAQNGGKFIQIGSDGKDESRKPKYLASYPSGCGG [0046] DADPDTDANVMQFRVTGEHIILTNGTPYMEVEPRTYRFRILNASNTRMLKLTNTQDKWSIIN [0047] PMGGTHPIHLHLVSFRVLDRRPFDIARIHLHLVSFQILDRRPFDLERYGRPVLLLNNKRWHDP [0048] VTEACGNTILVNGKAWFGPYTGRYVWHCHILEHEDYGLLPRSVKTQSISLAPAERYFLPIDH [0049] TIHHSDSQHEEPEVRYVWHCHILEHEDYQFGLPWVQIAIFRASRGFYTTRKYLDMMRPMDVTDKQ*[0050] 突变体漆酶的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示： [0051] MALEKFADELPIIETLQPQKVTMKECFHKLHSAVIGTPDGITWHYEQEGTGATPPDSDGYLH [0052] RDLPPTRLWGYNGLFPGPTIWSGDSMCLHARQACGSRRASIPDKTVVHLDVKTVVHLHGG [0053] KTVVHLHGGNQDENVYIKCMNDLPDKHDDSDGYPEVTPDDSDGYPEHHSESYPNKQRGA [0054] LLWYHDHAMAITHGGVPPGHQEPDVRLKLPSDAWFTKDEYDVPLLITDRTIYNKFGDIVYT [0055] GPAVPPPPSEFKETGPYFEREVYHKPLAQNGGKFIQIGSDGKDESRKPKYLASYPSGCGGDA [0056] DPDTDANVMQFRVTGEHIILTNGTPYMEVEPRTYRFSILNASNTRMLKLTNTQDKWSIINPM [0057] GGTHPIHLHLVSFRVLDRRPFDTARIHLHLVSFQILDRRPFDLERYGRPVLLLNNKRWHDPV [0058] TEACGNTILVNGKAWFGPYTGRYVWHCHILEHEDYGLLPRSVKTQSIRLAPAERYFLPIDHT [0059] IHHSDSQHEEPEVRYVWHCHILEHEDYQFGLPWVQIAIFRASRGFYTTRKYLDMMRPMDVTDKQ*[0060] 野生型漆酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示： [0061] ATGGCACTAGAAAAATTTGCAGATGAACTGCCGATTATCGAAACACTCCAGCCGCAGAA [0062] GGTCACCATGAAGGAATGCTTTCACAAGCTGCACTCCGCTGTCATTGGTACCCCGGACG [0063] GCATTACTTGGCACTATGAGCAAGAAGGCACCGGCGCAACGCCGCCGGACAGCGACGG [0064] CTACCTTCACCGCGATCTCCCGCCGACCCGGCTGTGGGGGTATAACGGTTTATTTCCCGG [0065] CCCGACGATCTGGTCTGGGGATTCCATGTGCTTGCACGCTCGACAAGCGTGTGGGAGCC [0066] GTCGAGCCAGCATCCCTGATAAGACTGTCGTTCATTTAGACGTGAAAACCGTCGTTCATT [0067] TACACGGCGGCAAAACCGTCGTCCATTTACACGGAGGAAACCAAGATGAAAACGTCTAT [0068] ATTAAATGGATGAATGACCTTCCGGATAAGCATGATGATAGTGACGGGTATCCAGAGGTC [0069] ACTCCAGATGACAGCGACGGTTATCCTGAGCACCATTCAGAAAGCTATCCAAACAAACA [0070] GCGCGGGGCTCTGTTATGGTATCACGATCACGCCATGGCGATTACGCACGGAGGCGTCA [0071] CGCCAGGCCATCAGGAACCCGATGTCCGCTTAAAACTGCCTTCAGACGCATGGTTCACA [0072] AAGGATGAATACGATGTGCCGCTTCTTATCACAGACCGCACGATCTATAACAAATTCGGC [0073] GACATTGTGTATACAGGCCCCGCCGTCCCGCCTCCTCCAAGTGAATTTAAGGAAACGGG [0074] TCCTTATTTTGAGAGAGAGGTATACCATAAACCGTTGGCACAAAACGGCGGGAAGTTTAT [0075] CCAAATCGGTTCTGACGGCAAAGATGAAAGCAGAAAGCCAAAGTACCTTGCCTCATACC [0076] CTTCCGGCTGCGGGGGCGACGCCGATCCGGATACAGACGCCAATGTGATGCAATTCCGC [0077] GTCACAGGAGAACATATCATTTTAACGAACGGCACCCCGTATATGGAAGTTGAACCGCG [0078] GACATATCGTTTCCGCATCCTTAATGCCTCCAATACGAGGATGCTTAAACTCACAAATAC [0079] GCAAGACAAATGGTCGATTATCAATCCGATGGGGGGAACCCATCCGATTCACCTGCATTT [0080] GGTCTCCTTCCGTGTGTTGGACCGGCGTCCGTTTGATATCGCGCGTATACACCTGCACCT [0081] TGTTTCCTTCCAAATCCTTGACCGGCGCCCTTTTGACTTAGAGCGTTACGGCAGACCCGT [0082] CCTTCTTCTTAACAACAAACGCTGGCACGATCCTGTCACTGAAGCATGCGGAAATACCA [0083] TTCTCGTCAATGGTAAAGCGTGGTTCGGGCCATACACTGGGCGGTACGTATGGCATTGCC [0084] ACATTCTTGAGCATGAAGACTATGGACTGCTTCCCCGCTCTGTCAAAACACAATCTATCA [0085] GCTTAGCCCCGGCAGAGCGGTATTTCCTTCCGATTGATCACACCATTCATCACAGTGACA [0086] GCCAGCATGAAGAGCCCGAGGTACGCTACGTATGGCACTGTCATATTTTAGAACATGAA [0087] GATTACCAATTCGGTCTGCCGTGGGTGCAAATCGCTATTTTCCGCGCATCCCGAGGTTTTT [0088] ATACGACGAGAAAGTATCTGGACATGATGAGACCGATGGACGTCACGGATAAGCAGTAA [0089] 突变体型漆酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4所示： [0090] ATGGCACTAGAAAAATTTGCAGATGAACTGCCGATTATCGAAACACTCCAGCCGCAGAA [0091] GGTCACCATGAAGGAATGCTTTCACAAGCTGCACTCCGCTGTCATTGGTACCCCGGACG [0092] GCATTACTTGGCACTATGAGCAAGAAGGCACCGGCGCAACGCCGCCGGACAGCGACGG [0093] CTACCTTCACCGCGATCTCCCGCCGACCCGGCTGTGGGGGTATAACGGTTTATTTCCCGG [0094] CCCGACGATCTGGTCTGGGGATTCCATGTGCTTGCACGCTCGACAAGCGTGTGGGAGCC [0095] GTCGAGCCAGCATCCCTGATAAGACTGTCGTTCATTTAGACGTGAAAACCGTCGTTCATT [0096] TACACGGCGGCAAAACCGTCGTCCATTTACACGGAGGAAACCAAGATGAAAACGTCTAT [0097] ATTAAATGCATGAATGACCTTCCGGATAAGCATGATGATAGTGACGGGTATCCAGAGGTC [0098] ACTCCAGATGACAGCGACGGTTATCCTGAGCACCATTCAGAAAGCTATCCAAACAAACA [0099] GCGCGGGGCTCTGTTATGGTATCACGATCACGCCATGGCGATTACGCACGGAGGCGTCC [0100] CGCCAGGCCATCAGGAACCCGATGTCCGCTTAAAACTGCCTTCAGACGCATGGTTCACA [0101] AAGGATGAATACGATGTGCCGCTTCTTATCACAGACCGCACGATCTATAACAAATTCGGC [0102] GACATTGTGTATACAGGCCCCGCCGTCCCGCCTCCTCCAAGTGAATTTAAGGAAACGGG [0103] TCCTTATTTTGAGAGAGAGGTATACCATAAACCGTTGGCACAAAACGGCGGGAAGTTTAT [0104] CCAAATCGGTTCTGACGGCAAAGATGAAAGCAGAAAGCCAAAGTACCTTGCCTCATACC [0105] CTTCCGGCTGCGGGGGCGACGCCGATCCGGATACAGACGCCAATGTGATGCAATTCCGC [0106] GTCACAGGAGAACATATCATTTTAACGAACGGCACCCCGTATATGGAAGTTGAACCGCG [0107] GACATATCGTTTCAGCATCCTTAATGCCTCCAATACGAGGATGCTTAAACTCACAAATAC [0108] GCAAGACAAATGGTCGATTATCAATCCGATGGGGGGAACCCATCCGATTCACCTGCATTT [0109] GGTCTCCTTCCGTGTGTTGGACCGGCGTCCGTTTGATACCGCGCGTATACACCTGCACCT [0110] TGTTTCCTTCCAAATCCTTGACCGGCGCCCTTTTGACTTAGAGCGTTACGGCAGACCCGT [0111] CCTTCTTCTTAACAACAAACGCTGGCACGATCCTGTCACTGAAGCATGCGGAAATACCA [0112] TTCTCGTCAATGGTAAAGCGTGGTTCGGGCCATACACTGGGCGGTACGTATGGCATTGCC [0113] ACATTCTTGAGCATGAAGACTATGGACTGCTTCCCCGCTCTGTCAAAACACAATCTATCC [0114] GCTTAGCCCCGGCAGAGCGGTATTTCCTTCCGATTGATCACACCATTCATCACAGTGACA [0115] GCCAGCATGAAGAGCCCGAGGTACGCTACGTATGGCACTGTCATATTTTAGAACATGAA [0116] GATTACCAATTCGGTCTGCCGTGGGTGCAAATCGCTATTTTCCGCGCATCCCGAGGTTTTT [0117] ATACGACGAGAAAGTATCTGGACATGATGAGACCGATGGACGTCACGGATAAGCAGTAA [0118] 以下将结合具体实施方式对本发明做进一步地解释说明。 [0119] 实施例1漆酶突变基因、表达载体及重组菌株的获得 [0120] 1.1漆酶突变基因的获得 [0121] 借助FoldX、Rosetta和YASARA软件，构建了漆酶的耐酸碱及热稳定突变体电子文库。同时采用半理性设计的方法，通过对催化机制的解析，最终确定通过对来源于短小芽孢杆菌NGJ763的野生型的漆酶氨基酸序列中第141、198、341、389和476位点的色氨酸、苏氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸，分别突变为半胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸，获得本发明的漆酶突变体。 [0122] 取短小芽孢杆菌NGJ763对数期种子液300mL于6个50mL离心管中，8000rpm离心 5min，弃上清，用600mL生理盐水清洗沉淀菌体2遍后，送上海生工进行基因组测序，得到野生型漆酶的编码基因序列及上下游序列信息，根据得到的基因组，利用引物Y1(含EcoRⅠ酶切位点)和Y2(含XbaⅠ酶切位点)扩增漆酶基因CotA(SEQ ID NO.3)，并连接于T载体上保存，并将此重组载体命名为T‑CotA。定点突变试剂盒采用上海生工的试剂盒，型号B639281，具体的操作步骤如下： [0123] (1)扩增野生型漆酶基因及各个点突变的引物。 [0124] 表1上述进行点突变所用引物如下 [0125] 引物名称 序列(5’‑3’) 引物长度(bp) Y1 CCGGAATTCATGGCACTAGAAAAATT 26 Y2 CTAGTCTAGATTACTGCTTATCCGTG 26 W141C‑1 AACGTCTATATTAAATGCATGAATGACCTTCCG 33 W141C‑2 CGGAAGGTCATTCATGCATTTAATATAGACGTT 33 T198P‑1 TTACGCACGGAGGCGTCCCGCCAGGCCATCAGGA 34 T198P‑2 TCCTGATGGCCTGGCGGGACGCCTCCGTGCGTAA 34 R341S‑1 ACATATCGTTTCAGCATCCTTAATGCCTCCAA 32 R341S‑2 TTGGAGGCATTAAGGATGCTGAAACGATATGT 32 I389T‑1 CGGCGTCCGTTTGATACCGCGCGTATACACCTGC 34 I389T‑2 GCAGGTGTATACGCGCGGTATCAAACGGACGCCG 34 S476R‑1 ACACAATCTATCCGCTTAGCCCCGGCAGAGCGGTA 35 S476R‑2 TACCGCTCTGCCGGGGCTAAGCGGATAGATTGTGT 35 [0126] (2)点突变：以W141C的点突变为例，用W141C‑1和W141C‑2这两个引物，以含有野生型漆酶基因CotA的重组T载体T‑CotA为模板，按照点突变试剂盒中的体系，加入其他试剂，进行PCR扩增加。扩增结束后，取10μL上述突变PCR扩增的产物，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，条带正确后加1μL消化酶于突变产物中，混匀，37℃孵育60min。 [0127] (3)转化：加入5μL突变后的产物于50μL DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30min；42℃准确热激45s后立即置于冰上冷却10min；加500μL LB培养基，180r/min，37℃培养1h；然后将培养液10000r/min离心5min，弃掉部分清液，保留100‑150μL上清轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，37℃过夜培养。 [0128] (4)阳性克隆子验证：挑取单菌落于500μL含有氨苄霉素抗性的LB培养基中，200r/min培养2‑3h后PCR鉴定，将筛选出的阳性克隆子送出测序，测序结果进行比对，挑选出符合核苷酸序列SEQ ID NO.3所示序列中第423位点G突变为C的阳性克隆子，该阳性克隆子即含有突变正确的重组质粒的突变体。 [0129] (5)其它位点的突变：以上述筛选正确的突变体为模板，逐个采用表1中各突变位点对应的引物对，采用上述同样的方法进行各个点的突变，最终筛选得到SEQ ID NO.4所示的漆酶突变基因。 [0130] 将上述各点突变后获得的漆酶基因BCotA(SEQ ID NO.4)连接于T载体上保藏，命名为T‑BCotA载体。 [0131] 本发明通过将突变后的漆酶基因连接于表达载体pPICZαA上得到pPICZαA‑BCotA，然后在毕赤酵母X33中，通过表达载体pPICZαA‑BCotA，实现对漆酶突变体的表达，具体如下：1.2重组表达载体的获得 [0132] 1.2.1酶切 [0133] 将含有漆酶突变基因的重组T载体T‑BCotA与表达载体pPICZαA，分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，酶切体系如下： [0134] 组分名称 体积 EcoR I 1μL Xba I 1μL 10×M Buffer 2μL 载体T‑BCotA(或pPICZαA) ≤1μg 无菌水 up to 20μL 总体系 20μL [0135] 以上反应体系在37℃水浴下酶切过夜，酶切后得到漆酶突变基因BCotA，及线性化载体pPICZαA的线性片段。 [0136] 1.2.2连接 [0137] 上述线性片段，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒纯化回收后，用T4 DNA连接酶连接。连接体系如下： [0138] 组分名称 体积 突变的BCotA基因 13μL pPICZαA线性载体 4μL 10×T4 Buffer 2μL T4 DNA连接酶 1μL 总体系 20μL [0139] 以上反应在16℃反应16h。 [0140] 连接产物转化大肠杆菌DH5α：取100μL大肠感受态加入20μL上述连接产物，充分混匀后冰浴30分钟，然后42℃水浴90秒，再冰浴5分钟后加入500μL无抗性的LB培养基，在37℃、150rpm摇床培养1h后，涂布到含有博莱霉素(终浓度25μg/ml)的LB平板上，37℃培养 12h。 [0141] 重组表达载体pPICZαA‑BCotA的筛选：挑选平板上单菌落至LB液体培养基(含博莱霉素)中培养，12h后利用引物Y1和Y2，通过菌落PCR筛选重组表达载体pPICZαA‑BCotA。 [0142] 重组表达载体pPICZαA‑BCotA的提取：对于测序正确的阳性克隆，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃、150rpm培养10h，至OD600约1.0左右，然后采质粒提取试剂盒，提取重组表达载体pPICZαA‑BCotA。 [0143] 1.3重组菌株的获得 [0144] 重组表达载体pPICZαA‑BCotA用限制性核酸内切酶SacI线性化，37℃酶切过夜。线性化酶切反应体系为： [0145] [0146] 以上反应体系在37℃下反应2h，酶切后的质粒用DNA纯化试剂盒纯化后，电击(电压2.0k V，电容25μF，电阻200Ω，电击时间为5ms)转入毕赤酵母X33感受态细胞，取200μL涂布于含有Zeocin终浓度100ug/ml的YPDS固体培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，1mol/L山梨醇，20g/L琼脂，115℃高压灭菌20min)，30℃倒置培养，所得菌株为X33/pPICZαA‑BCotA毕赤酵母工程菌。 [0147] 1.4野生型漆酶基因表达菌株的获得 [0148] 采用上述实施例1.2和1.3同样的技术手段，将含有漆酶原始基因的重组T载体T‑CotA与表达载体pPICZαA，分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，然后连接得到表达野生型漆酶基因的表达载体pPICZαA‑CotA，再用限制性核酸内切酶SacI线性化后，转入毕赤酵母X33感受态细胞，得到漆酶原始基因的表达工程菌株X33/pPICZαA‑CotA。 [0149] 实施例2漆酶的制备 [0150] 2.1突变后的漆酶的制备 [0151] 采用实施例1构建的重组菌株X33/pPICZαA‑BCotA发酵制备，方法如下： [0152] 3m3种子罐中的种子培养：6％接种量，温度30℃，罐压0.04‑0.08Mpa，初始转速 3 100rpm，初始风量20m/h，通过加转速和风量控制溶氧大于30％，最高转速600rpm，最高通 3 风量200m/h，补氨控制pH在5.5，培养49h； [0153] 种子培养基组成：甘油3％，磷酸一铵5％，磷酸氢二钠0.3％，硫酸镁2.5％，硫酸钾 1％，硫酸钙0.3％，氢氧化钾0.2％，磷酸0.06％，pH在5.5； [0154] 60m3发酵罐中的发酵培养：按照发酵罐培养基体积的6％进行接种，培养温度30 3 ℃，罐压0.04‑0.08MPa，初始转速100rpm，初始风量200m/h，最高转速600rpm，最高通风量 3 4000m/h；补料的控制：当发酵至菌体湿重达到65g/L时，开始流加35％的甘油，流加速度为 650kg/h，当菌体湿重达到150g/L时，停止流加甘油，饥饿处理1.3h，然后开始流加甲醇，前 2h，流加甲醇的流速为130kg/h，2h后，甲醇的流加速度，每小时增加30kg，直至达到最大补料速率为300kg/h，保持该补料速度直至发酵结束。溶氧的控制：开始流加甲醇前，通过调节转速和风量控制溶氧达到30％，开始流加甲醇后，控制溶氧20％，达到最高转速和通风量后，溶氧不再控制。补氨控制pH在5.5，菌体自溶严重时结束发酵，培养周期200h。 [0155] 发酵培养基组成：甘油5％，磷酸一铵7％，磷酸氢二钠0.5％，硫酸镁2.5％，硫酸钾 1％，硫酸钙0.4％，氢氧化钾0.2％，磷酸0.03％，pH在5.5。 [0156] 进行3批的发酵情况如下，平均发酵酶活力为：106673U/L。 [0157] 批次 发酵周期(h) 发酵酶活力(U/L) 1 200 106561 2 200 107032 3 200 106426 [0158] 2.2野生型漆酶的制备 [0159] 采用上述实例2.1同样的发酵方法，采用X33/pPICZαA‑CotA重组菌进行3批的发酵情况如下，平均发酵酶活力为：30334U/L。 [0160] 批次 发酵周期(h) 发酵酶活力(U/L) 1 200 29793 2 200 30182 3 200 31027 [0161] 实施例3漆酶酶活的测定方法 [0162] 3.1本发明涉及的漆酶活的定义 [0163] 采用ABTS方法测定漆酶酶活时，定义每分钟转化1μmol底物时所需要的酶量作为一个活力单位(如未特别说明，反应条件为pH5.5，温度38℃)。 [0164] 3.2酶活力测定步骤 [0165] 预热：取2.6mL pH值为5.5的磷酸‑柠檬酸缓冲溶液于试管中，在试管中加入 0.5mL2,2‑联氮‑二(3‑乙基‑苯并噻唑‑6‑磺酸)二铵盐(ABTS)溶液(ABTS的终浓度为0.5mM)置于38℃水浴锅中预热3min； [0166] 反应：加入0.1mL漆酶酶液，震荡均匀； [0167] 测量：将震荡均匀的样品用分光光度计进行动力学测量，在420nm波长下测量30s内每秒钟OD值的变化量(反应速率为匀速反应)并计算酶活力； [0168] 酶活力公式： [0169] [0170] 式中：△OD：吸光度OD的变化值；V总：反应总体积；n：酶液稀释倍数；△t：反应时间； 4 ‑ ‑ V0：酶液的体积；ε：底物的摩尔吸光系数3.6×10(mol/L) 1·cm1。 [0171] 实施例4漆酶突变体的酶学特性 [0172] 本发明提供的漆酶突变体，最适反应pH为4.5，在pH3.0‑9.0的条件下处理24h后，相对酶活力仍然保持在90％以上，最适反应温度为85℃，在40‑80℃条件下保温15h，仍能保留95％以上的酶活，具体如下： [0173] (1)最适反应pH [0174] 取实施例2.1批次1和实施例2.2批次1发酵液离心得到的上清液作为粗酶液，在温度为38℃条件下，分别测定在pH值2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0条件下漆酶活力，并计算相对酶活力，以酶活最高者为100％。测定结果如图1所示，突变后的漆酶在pH为4.5时酶活最高。 [0175] (2)耐碱性 [0176] 取实施例2.1批次1和实施例2.2批次1发酵液离心得到的上清液作为粗酶液，分别用0.1M的NaOH或0.1M的HCl将其酶液的pH调整为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0分别置于室温条件下静置24h后，在38℃、pH4.5的条件下测定酶活力，并计算相对酶活力，以原始酶活为100％。测定结果如图2所示，在pH3.0‑ 9.0的条件下处理24h后，突变后的漆酶相对酶活力仍然保持在90％以上。 [0177] (3)最适反应温度 [0178] 取实施例2.1批次1和实施例2.2批次1发酵液离心得到的上清液作为粗酶液，在pH5.5条件下，分别在40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95℃下测定漆酶活力，计算相对酶活力，以酶活最高者为100％。结果如图3所示，突变后的漆酶最适反应温度为85℃。 [0179] (4)热稳定性 [0180] 取实施例2.1批次1和实施例2.2批次1发酵液离心得到的上清液作为粗酶液，将酶液分别置于35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95℃条件下保温处理15h，保温结束后，在38℃、pH 5.5的条件下测定酶活，并计算相对酶活力，以原始酶活为100％。实验结果如图4所示。突变后的漆酶在40‑80℃条件下保温15h，仍能保持95％以上酶活。热稳定性较野生型漆酶有明显提升。 [0181] 实施例5突变后的漆酶对黄曲霉毒素的降解实验 [0182] 本实施例用野生型漆酶和突变后的漆酶对黄曲霉毒素的降解能力进行分析。 [0183] 5.1酶解方法 [0184] 使用相同蛋白浓度(降解体系内终浓度0.003ng/mL)的酶用于降解，黄曲霉毒素B1的浓度为50μg/mL，为达到最好的酶解效果及可比性，分别将野生型漆酶和突变后的漆酶分别置于55℃和85℃的最适反应温度下，及分别在各自最适pH6.0和pH4.5的磷酸‑柠檬酸缓冲溶液中，对黄曲霉毒素进行降解，每隔20min测定一次黄曲酶毒素B1的含量(黄曲酶毒素B1的含量，按照国标GB/T 17480‑2008的方法测定)。 [0185] 5.2结果分析 [0186] 依照上述方法，本发明测定了野生型漆酶和突变后的漆酶对黄曲霉毒素B1的降解效率。结果如图5所示(横轴为时间min，纵坐标为降解效率)，改造过的漆酶降解黄曲霉毒素B1的能力明显优于野生型漆酶。野生型漆酶需要180min才能完全降解体系内的黄曲霉毒素B1，而改造过的漆酶仅仅需要60min就能将体系内的黄曲酶毒素B1完全降解。 [0187] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。