技术领域
[0001] 本发明涉及微生物，尤其涉及一株不动杆菌及应用。
相关背景技术
[0002] 近年来，随着我国经济的飞速发展，未经处理的工业废水和生活污水大量排入江河湖泊中，造成水体富营养化日趋严重，使得藻类水华的爆发更加频繁，严重破坏了生态环境，影响经济的发展，同时对人类健康也造成极大的威胁。因此寻找一种能够有效控制蓝藻水华的方法尤为重要。目前控制藻类水华常用的方法有物理法，化学法和生物法。其中物理法主要包括人工打捞、机械清除、电磁波和超声波除藻等多种方法。这些方法可以在短期内去除某些藻类聚集体，但效果不彻底。化学法主要是通过向富营养化的水体中投加杀藻剂杀死藻细胞或添加絮凝剂使之沉淀，这种方法具有快速高效的优点，但容易造成二次污染，因此不适于应用在饮用水域地区。在物理法和化学法治理藻类水华效果不佳的情况下，生物控藻法作为一种环保经济的方法逐渐引起了人们的关注。
[0003] 越来越多的学者认识到溶藻细菌在水生生态系统中具有重要作用，并且与水华的突然消亡有着密切的关联。但目前利用溶藻菌来控制藻类水华的研究中，溶藻菌要达到较高的细胞浓度才具有溶藻效果，因此筛选到能够在低细胞浓度条件下具有显著溶藻效果的菌株，才有利于促进该技术的实际应用。在我国的大多数湖泊藻类水华日益严重的情况下，寻找更多种类具有显著溶藻效果的溶藻细菌对于蓝藻水华的控制具有重要的现实意义。 发明内容
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足，提供一株具有较强溶藻活性的不动杆菌R14，应用于抑制蓝藻水华。
[0005] 本发明的一株不动杆菌(Acinetobacter sp.)，命名为不动杆菌R14，该菌株 己在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.6550，保藏日期为2012年9月14日。
[0006] 上述具有溶藻活性的不动杆菌R14为革兰氏阴性菌，细胞形态为杆状，0.5～0.8×0.5～1.2μm，无芽孢和鞭毛，在营养琼脂上培养时菌落平坦，颜色为淡黄色，色素不扩散。化能异养菌，发酵代谢，可利用中长链烃、乙醇和苹果酸，不能利用甲酸盐、乳酸盐和丙酸盐，氧化酶阴性，接触酶、明胶水解、溶血性皆为阳性；葡萄糖产酸微弱；最适生长温度为30℃。通过对其16S rRNA基因序列分析及同源性比较得知，该菌株与某不动杆菌菌株具有99％的同源性，故鉴定为不动杆菌属细菌，将其命名为不动杆菌R14，该菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登录号为JX845720。
[0007] 本发明的不动杆菌R14应用于抑制蓝藻水华。
[0008] 具体作法包括：
[0009] 1、将不动杆菌R14接种到pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃、180rpm的条件下发酵培养24小时获得其含菌发酵液，应用于抑制蓝藻水华。 [0010] 当不动杆菌R14在菌-藻混合液中的起始菌体浓度低至7.5×103CFU/mL时，仍具有显著的溶藻效果。
[0011] 2、将上述含菌发酵液于5000rpm离心20min后用0.22μm孔径的醋酸纤维滤膜进行过滤，获得无菌上清液，应用于抑制蓝藻水华。
[0012] 所述蓝藻为铜绿微囊藻。
[0013] 本发明不动杆菌R14的优点和特点是：
[0014] 1、不动杆菌R14的含菌发酵液及无菌上清液对于铜绿微囊藻均具有显著的溶藻效果。
[0015] 2、不动杆菌R14在菌-藻混合液中的起始菌体浓度低至7.5×103CFU/mL时，对于铜绿微囊藻仍具有显著的溶藻效果。
[0016] 3、不动杆菌R14分泌的溶藻物质具有一定的温度和pH稳定性，经过30min的-20，4，50，80℃的温度处理或2.0，5.0，9.0，12.0的pH处理后，其无菌上清液仍具有溶藻活性。 [0017] 基于上述特点，不动杆菌R14及其含菌发酵液和无菌上清液，均可用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于蓝藻水华的控制。
具体实施方式
[0023] 下面通过实施例对本发明作详细说明，下述实施例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0024] 1.溶藻细菌的分离筛选
[0025] 将铜绿微囊藻9110接种到BG11液体培养基，置于光照培养箱中培养到对数期6 -2 -1
(藻细胞密度约为5×10 个/mL)，培养条件：光照强度为40μmol photons m s ，光暗周期比为12h∶12h，温度为25℃；将藻液进行多次离心(5000rpm，20min)以富集藻体，将其与采集自太湖的水样混匀后涂布于BG11固体平板，置于光照培养箱中培养；待平板上出现明显溶藻圈时挑取菌落并在牛肉膏蛋白胨(NB)固体培养基上划线纯化；对分离到的菌株分别进行-20℃甘油管保藏和-70℃超低温保藏。
[0026] 2.溶藻效果的验证
[0027] 将分离到的菌株接种到NB液体培养基中，于30℃，180rpm的条件下摇床培养24小时获得含菌发酵液，取5mL含菌发酵液加入到100mL铜绿微囊藻的藻液中(藻细胞密度6
约为5×10 个/mL)，对照组加入5mL无菌NB液体培养基，每个实验设置三个平行，将实验组和对照组的藻液置于光照培养箱中培养，培养条件如实施例1所述。在接种后的4天和7天用血球板计数法测定藻细胞浓度以计算溶藻率，选取了溶藻效果最好的一株菌进行后续研究，该菌株代号为R14。
[0028] 溶藻率(A)计算方法：
[0029] A(％)＝(1-Tt/Ct)×100
[0030] 其中T和C分别代表实验组和对照组中的藻细胞浓度，下标t代表从接种开始的实验时间。
[0031] 3.R14菌株的鉴定
[0032] 用形态观察、染色、生理生化反应和16S rRNA序列分析等方法对菌株R14进行菌种鉴定。该菌株为革兰氏阴性菌，细胞形态为杆状，0.5～0.8×0.5～1.2um，无芽孢和鞭毛，在营养琼脂上培养时菌落平坦，颜色为淡黄色，色素不扩散。化能异养菌，发酵代谢，可利用中长链烃、乙醇、苹果酸，不能利用甲酸盐、乳酸盐和丙酸盐，氧化酶阴性，接触酶、明胶水解、溶血性皆为阳性；葡萄糖产酸微弱；最适生长温度为30℃。通过PCR得到扩增序列，经序列测定后与GenBank中的已有序列进行比对，发现其与一不动杆菌菌株(Acinetobacter haemolyticus)的同源性可达到99％，因此可鉴定为不动杆菌属，命名为不动杆菌R14(Acinetobacter sp.R14)。该菌种已保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6550，保藏日期为2012年9月14日。该菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登录号为JX845720。
[0033] 4.菌藻混合液中菌株R14不同起始菌体浓度条件下的溶藻效果
[0034] 将菌株R14在30℃，180rpm的条件下摇床培养24小时后，用菌落计数法对其菌细9
胞密度进行测定，为1.58×10CFU/mL。按照实施例2所述方法获得不动杆菌R14的含菌发酵液，用BG11液体培养基对其进行梯度稀释：取1mL菌液加入到9mL无菌BG11液体培养-1 -5 -3 -4
基中，即得到10 的稀释液，依次进行稀释，得到10 浓度梯度的菌液。分别取10 、10 和-5 6
10 密度梯度的菌液5mL接种到100mL铜绿微囊藻9110中(藻细胞密度约为5×10 个/
4 3 2
mL)，获得菌株R14的菌浓度分别为7.5×10、7.5×10 和7.5×10CFU/mL的菌藻混合液。
对照组的藻液中加入5mL无菌BG11液体培养基；将对照组和实验组的藻液置于光照培养箱培养，接种后每天测定藻细胞浓度，连续测定7天；每个实验设置三个平行，最终的数据表示成平均值±标准差的形式。
[0035] 实验结果表明：当不动杆菌R14在菌-藻混合液中的起始菌体浓度低至3
7.5×10CFU/mL时，对于铜绿微囊藻9110仍具有显著的溶藻效果，如图1所示。 [0036] 5.菌株R14溶藻模式的研究
[0037] 按照实施例2所述方法获得含菌发酵液，将其于5000rpm离心20min后用0.22μm孔径的醋酸纤维滤膜进行过滤，获得无菌上清液；分别取5mL含菌发酵液和 无菌上清液接6
种到100mL铜绿微囊藻9110中(藻细胞密度约为5×10 个/mL)，摇匀后置于光照培养箱中培养，于接种后的4天和7天测定藻细胞浓度。对照组加入等量的无菌NB液体培养基。
每个实验设置三个平行，最终的数据表示成平均值±标准差的形式。
[0038] 实验结果如图2所示，由图2可以看出，加入无菌上清液的实验组对于铜绿微囊藻9110具有一定的溶藻效果，但其溶藻率低于加入含菌发酵液的实验组，表明菌株R14部分通过分泌溶藻物质来进行溶藻。
[0039] 6.菌株R14无菌上清液的温度和pH稳定性分析
[0040] 按照实施例5所述方法获得无菌上清液后对其进行如下不同温度和pH的处理：温度处理为将无菌上清液分别置于-20℃，4℃，50℃和80℃的环境中处理30min，pH处理为通过向无菌上清液中加入酸或碱液使其pH达到2.0、5.0、9.0和12.0，保持30min后重新调整到7.0。分别取5mL各处理组的无菌上清液加入到100mL铜绿微囊藻9110中(藻细胞密度6
约为5×10 个/mL)，另外将5mL未经处理(30℃，pH7.0)的R14上清液加入100mL藻液中以作对比，对照组加入等量的无菌NB液体培养基。将所有藻液置于光照培养箱中培养，并在接种后的4天和7天测定藻细胞浓度。每个实验设置三个平行，最终数据表示成平均值±标准差的形式。
[0041] 实验结果如图3、图4所示，由图3、图4可知，与未经处理的无菌上清液(30℃，pH7.0)相比，经过-20℃，4℃，50℃，80℃温度处理或pH＝5.0，9.0的处理后，其溶藻效果未受到显著影响；经过2.0和12.0的pH处理后，其无菌上清液溶藻效果有所降低，但仍具有一定的溶藻活性，说明不动杆菌R14分泌的溶藻物质具有一定的温度和pH稳定性。
