[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及吲哚菁绿二聚体纳米复合物及制备方法和应用。

[0002] 光动力治疗与激发光、光敏剂、分子氧三大要素密切相关，其作用机制是：在外源光激发下，光敏剂吸收光子，从基态跃迁到单重激发态，再通过系间窜越，到达寿命相对较1
长的三重激发态，最后将能量转移到分子氧生成单线态氧(O2)，这些毒性极强的活性氧导致癌细胞凋亡或坏死。光动力治疗的效果高度依赖于肿瘤组织中的氧含量。然而，肿瘤组织常因细胞快速生长和血液供应不足易形成缺氧微环境，光动力治疗疗效明显受限。同时，光动力治疗过程快速耗氧，会加剧肿瘤组织缺氧，进一步影响光动力治疗疗效。光热治疗则是利用单重激发态，经过非辐射跃迁回到基态，产生热效应。从光动力和光热效应产生机制来看，二者存在一定的竞争关系，很难同时实现高效光动力和光热治疗。

[0003] 吲哚菁绿是一种临床广泛应用的近红外染料，其水溶液的最大吸收波长为780nm，可用于肝功能评估、眼科血管造影和肿瘤切除的导航，也可以作为光敏剂用于光动力治疗肿瘤。但是，其水溶液存在稳定性差、易发生光漂白、单线态氧产率低等不足，制约了其光动力治疗效果。2023年，多伦多大学和巴西圣保罗大学的研究团队合作研制了吲哚菁绿二聚体的纳米结构，可以有效地稳定油滴形成的纳米乳液(Angew.Chem.Int.Ed.2023,62,e202305564)。在乳液界面，吲哚菁绿自发地氧化二聚生成稳定的吲哚菁绿二聚体，并能有序地排列形成J‑聚集，从而导致吸收峰红移到894nm，该纳米乳液具有优异的光热效应，可用于光热治疗肿瘤。但是，制备该纳米乳液需要用到引发剂三辛酸甘油酯和有机溶剂氯仿，并用超声处理多次，反应时间长，过程复杂。另外，单一的光热治疗使用光来提高组织温度并实现局部光凝，不可避免产生温度梯度，会导致正常组织的热损伤，增加不良反应的风险。如何利用吲哚菁绿二聚体的光热效应，实现光热和光动力治疗协同，为多模态治疗肿瘤提供材料支持，并推动其临床应用，具有重要意义。

[0036] 本发明所用的原材料均从阿拉丁试剂公司购得。荧光发射光谱采用Edinburgh公司的FS 5荧光光谱仪在室温下测定，激发波长为480nm，扫描波长范围500～700nm；粒径采用马尔文Zetasizer进行动态光散射测量；紫外吸收光谱采用Agilent公司的Cary5000紫外‑可见分光光度计在室温下测定，扫描波长范围200～1200nm。

[0037] 实施例1：纳米复合物的制备

[0038] 称取100mg吲哚菁绿，加入10mL超纯水溶解，70℃反应8h，反应过程中进行搅拌，搅拌的速度为500转/分，反应结束得到纳米颗粒水溶液，其吸收光谱如附图1所示，位于895nm处。纳米颗粒呈球状，平均粒径200nm，Zeta电位为‑22.5mV，如附图2所示。取2mL纳米颗粒水溶液，密闭下通入用注射器导入2mL氧气，往复1000次，得到的纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料的平均粒径为300nm，Zeta电位为‑32.5mV，如附图2所示。纳米氧气泡组装吲‑1哚菁绿二聚体复合材料水溶液的氧含量达到32mg.L 。

[0039] 实施例2：纳米复合物的制备

[0040] 称取50mg吲哚菁绿，加入10mL超纯水溶解，80℃反应6h，反应过程中进行搅拌，搅拌的速度为800转/分，反应结束得到纳米颗粒水溶液，其最大吸收波长为895nm。纳米颗粒呈球状，平均粒径189nm，Zeta电位为‑22.0mV。取2mL纳米颗粒水溶液，密闭下通入用注射器导入2mL氧气，往复800次，得到的纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料的平均粒径为285nm，Zeta电位为‑32.0mV。纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料水溶液的氧含量为‑1
30mg.L 。

[0041] 实施例3：纳米复合物的制备

[0042] 称取200mg吲哚菁绿，加入10mL超纯水溶解，100℃反应4h，反应过程中进行搅拌，搅拌的速度为1000转/分，反应结束得到纳米颗粒水溶液，其最大吸收波长为895nm。纳米颗粒呈球状，平均粒径211nm，Zeta电位为‑24.0mV。取2mL纳米颗粒水溶液，密闭下通入用注射器导入2mL氧气，往复1200次，得到的纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料的平均粒径为308nm，Zeta电位为‑34.0mV。纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料水溶液的氧含量‑1达到31mg.L 。

[0043] 实施例4：光热效应评估

[0044] 将吲哚菁绿二聚体复合材料水溶液及纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料2
水溶液(实施例1)稀释到浓度为100μg/mL，取3mL。在波长为880nm，功率密度为1W/cm的激光照射下，使用热成像仪间隔1min记录其温度变化；如附图3所示，二者的光热效应相当。

[0045] 实施例5：活性氧的生成

[0046] 以二苯基四氢呋喃作为1O2指示剂，用于评估纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合1
材料的O2生成。将吲哚菁绿二聚体复合材料水溶液及纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合
2
材料水溶液(实施例1)稀释到浓度为10μg/mL，取3mL。在波长为880nm，功率密度为1W/cm 的激光照射下，记录二苯基四氢呋喃在420nm处的吸收峰随时间的变化。如附图4所示，与吲哚
1
菁绿二聚体水溶液相比，纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料水溶液的O2生成明显提升。

[0047] 以氨基苯基荧光素作为ROS指示剂，用于评估纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复2
合材料的ROS产率。在波长为880nm，功率密度为1W/cm的激光照射下，记录氨基苯基荧光素在525nm处的吸收峰大小随时间的变化。如附图5所示，与吲哚菁绿二聚体水溶液相比，纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料水溶液的ROS生成明显提升。

[0048] 性能检测

[0049] 本发明下述性能检测所用实施例的材料均采用实施例1制得到的目标产品进行性能检测。

[0050] 实施例6：细胞试验

[0051] 选择人舌鳞癌细胞(Cal 27)作为细胞实验的研究对象。将Cal27细胞以1.0×105细胞每培养皿的密度接种在培养皿中。在标准培养箱中培养24h。PBS洗涤3次，然后用相同浓度(10μg/mL)的吲哚菁绿二聚体溶液及纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料溶液(实施例1)处理细胞。进一步孵育12h后，用PBS将细胞洗涤三次，然后用4％的多聚甲醛固定20min，随后用DAPI染色15min。最后，用PBS将细胞洗涤三次后，立即通过激光共聚焦显微镜进行观察。结果如附图6所示，Cal27细胞对吲哚菁绿二聚体组装前后摄取能力差别不大。

[0052] 使用CCK‑8试剂盒检测细胞活力，用来评价纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合4
材料的细胞毒性。首先，Cal27细胞以每孔1×10的密度接种在96孔板中，在标准细胞培养箱中培养24h。然后用PBS将细胞洗三遍，然后用不同浓度的吲哚菁绿二聚体溶液及纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料溶液处理细胞。进一步孵育12h后，用PBS洗涤细胞3次，使用CCK‑8检测细胞代谢活力。结果如附图7所示，吲哚菁绿二聚体组装前后对Cal27细胞的毒性差别不大。

[0053] 为了检测激光毒性，Cal27细胞以每孔1×104的密度接种在96孔板中，培养24h。首先丢弃培养基，然后替换为包含不同浓度的吲哚菁绿二聚体水溶液及纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料的细胞培养液，孵育12h。然后在4℃环境温度下，用波长为880nm，功率密度为1W/cm2的激光照射5min。再孵育24h后，将细胞用PBS洗涤3次，用CCK‑8检测细胞活力。结果如附图7所示，激光照射下，与相应的吲哚菁绿二聚体水溶液相比，纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料溶液对Cal27细胞的杀伤能力明显增强。

[0054] 以2,7‑二氯荧光素二乙酸酯作为细胞内1O2的指示剂。将Cal27细胞以1.0×105细胞每培养皿的密度接种于培养皿中，培养24h，随后与吲哚菁绿二聚体水溶液及纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料溶液孵育过夜。去除培养液，PBS洗涤后，随后用2,7‑二氯荧2
光素二乙酸酯(10μM，1mL)孵育20min，然后在室温下，使用波长为880nm，功率密度为1W/cm的激光照射5min，随后使用激光共聚焦显微镜拍摄荧光图。结果如附图8所示，与吲哚菁绿
1
二聚体水溶液相比，纳米氧气泡组装吲哚菁绿二聚体复合材料溶液在细胞内O2生成明显提升。

[0055] 实施例7：纳米复合物动物试验

[0056] 选择Cal27荷瘤裸鼠作为抑瘤疗效评价研究对象。将Cal27细胞(2×108个/mL，3
0.1mL)经皮下注射至裸鼠体内，建立裸鼠Cal27移植瘤模型。当肿瘤体积达到80mm时，进行抗肿瘤效果试验。15只裸鼠随机分为5组：(1)空白对照组(每只裸鼠注射100μL PBS不照射
2
激光)；(2)单纯激光组(每只裸鼠用880nm 1W/cm激光照肿瘤区域射10min)；(3)纳米颗粒水溶液(实施例1)+激光治疗组(每只裸鼠在肿瘤周围注射100μL 80μg/mL吲哚菁绿二聚体
2
纳米颗粒，用880nm 1W/cm激光照肿瘤区域射10min)；(4)纳米复合材料水溶液(实施例1)+激光治疗组(每只裸鼠在瘤周注射100μL 80μg/mL纳米氧气泡组装复合物后，用880nm1W/
2
cm激光照肿瘤区域射10min)。所有裸鼠每三天治疗一次。在实验的最后6天没有进行任何治疗。治疗期间每隔2天测量肿瘤体积。使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝长度×宽度×高度×π/6。结果表明：(1)单纯激光组：14天后，对照组肿瘤体积急剧增加；单纯激光组肿瘤体积明显增加，体积为对照组的0.91；(2)纳米颗粒+激光治疗组肿瘤生长受到抑制，肿瘤体积减小，体积为对照组的0.23；(3)纳米复合物+激光治疗组肿瘤生长受到明显抑制，肿瘤体积大大减小，为对照组的0.13。

[0057] 采用上述纳米复合物治疗两周后，处死裸鼠并解剖重要器官(心脏，肝，脾，肺，肾)进行HE染色。心肌细胞未见明显浑浊或肿胀；肝脏组织未出现明显纤维化或炎症；脾脏组织未出现明显淤血或脾小体增生；肺部组织未出现明显的出血或白细胞浸润；肾脏组织未见明显细胞坏死，增生等病理性改变。以上结果证实了上述纳米复合物具备优秀的生物相容性，与纳米颗粒没有差异。

[0058] 对连续3天静脉注射上述纳米复合物(剂量为500μg/kg)的大鼠血样进行了血常规、肝肾功能及心功能的生化分析。红细胞，白细胞，血红蛋白，血小板，平均红细胞体积，平均红细胞血红蛋白浓度和平均红细胞血红蛋白等各项血液生化指标均在正常范围内，上述纳米复合物与纳米颗粒间没有差异。

[0059] 需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。