[0001] 本发明涉及肿瘤的生物治疗技术，研发基因表达调控以消除肿瘤干细胞性质的候选生物药物。发明方法制备的产物能防止肿瘤恶性增殖与转移、降低临床难治性提高治疗效率。技术背景

[0002] 肺癌在我国城市恶性肿瘤的发病中已高居首位，且其发病率仍呈明显上升趋势，每年增长率高达26.9％，预计到2025年中国将成为世界第一肺癌大国。小细胞肺癌的发病率约占全部肺癌患者的20％，发病人数也将达到相当数量。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7‑10％，在妇女仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要病因。乳腺癌被发现是所有年龄段的[1]中最具侵袭性的癌症。2020年乳腺癌患病率(5年)排名第一(15.4％)，高于所有其他癌症。肿瘤干细胞(CSCs)或肿瘤起始细胞(TICs)具有自我更新和分化能力，可产生不同的肿瘤细胞后代。

[0003] 肿瘤干细胞(CSCs)是存在于所有亚型癌细胞的一个亚群。化疗耐药、患者生存率低。干细胞性质相关分子SOX2已被确定，并被认为是多种癌症的核心多能性相关转录因子之一。我们前期的实验研究发现，miR‑145‑5p在骨髓间充质干细胞中表达较高，miR‑145‑5p能通过下调抑制SOX2可以抑制癌细胞的干性、和侵袭性；SOX2为干细胞相关基因，下调后，能抑制乳腺癌细胞的癌变和化疗耐药性；miR‑145‑5p是多种癌症的肿瘤抑制因子miRNA，包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、肾癌和胃肠道癌，对临床上易转移复发且化疗抗性的肿瘤有抑制、增强治疗效果的临床应用价值。

[0004] miRNA(MicroRNA)是一类由内源基因编码的长度约为19‑24nt的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA通常位于基因间(intergenic)或位于内含子(intronic)区域，因此普遍认为它并作为编码其他类型基因的一部分而被转录，这些小分子RNA通过碱基配对与靶mRNA序列的3′UTR区或编码区结合，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译，从而调控基因的表达。miRNA以一种目前尚未完全清楚的机制结合到基序基本互补的mRNA上，但这种结合并不像RNAI反应那样参与mRNA降解，而是阻止所结合的mRNA的翻译，导致相应基因表达水平的降低。细胞核中编码miRNA的基因在RNA聚合酶II的作用下转录形成长度约为几百个核苷酸的初级转录物‑pri‑miRNA；然后在一种类Dicer酶‑DCL1的作用下形成miRNA前提pre‑miRNA，该前提长度一般为64‑303nt，DCL1继续作用于pre‑miRNA而形成双链miRNA；最后双链miRNA在miRNA甲基转移酶HEN1的作用下，使3′端最后一个核苷酸发生甲基化修饰。甲基化的主要作用是阻止转移酶、聚合酶的活性。以上过程均在细胞核中完成。大多数pri‑miRNA最后一个碱基是尿嘧啶，这通常被认为是聚合酶III提前终止的转录产物。pri‑miRNA的第一步剪切是由Drosha酶完成，其产物是70nt的发夹结构前体(pre‑miRNA)。pre‑miRNA经exportin‑5由细胞核输出，进入细胞质。

[0005] miRNA(microRNA)可包裹在外泌体中，它们可以被邻近或远处的细胞摄取，并随后调节受体细胞。外泌体(Exosome)是细胞分泌的直径为40‑100nm的膜囊泡，几乎存在于所有生物液体中。大多数细胞释放到细胞外空间，其中含有蛋白质、mRNA、微小RNA(miRNA)和其他非编码RNA(ncRNA)等。释放的外泌体可以被邻近细胞或远处细胞摄取，随后调节受体细胞。外泌体作为″天然纳米颗粒″可用于药物输送载体，其制药潜力被越来越多的研究开发所关注。它们具有低细胞毒性、最大化药物生物利用度，以及出色的靶向归巢特异性等。有越来越多的临床试验开始探索外泌体的治疗效果。因此，肿瘤来源的外泌体可用作无细胞治疗载体，以浸润肿瘤微环境(TME)进行树突状细胞的激活。近日武汉大学研究工程化外泌体HEK 293T‑Exos在患者来源的肿瘤器官中，产生有效的肿瘤抑制作用。

[0006] 目前，miRNA可以通过工程化制备。比如真核细胞表达载体感染人真核细胞经过选择，可获得过表达转录生成大量pre‑miRNA，在细胞中包裹成为miRNA外泌体，自然分泌到细胞外，获取的外泌体经验证可以进入肿瘤细胞，改善肿瘤细胞的性质，经动物实验证明对肿瘤治疗和抑制转移有应用前景。

[0007] 本发明制备miR‑145‑5p，通过外泌体导入方式靶向SOX2基因，强相互作用消除干细胞性质，研发抑瘤增殖抑制先导物，为控制癌干细胞性的肿瘤治疗应用。