[0001] 本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及刺激外泌体分泌及增强外泌体抗炎功能的方法。

[0002] 间充质干细胞衍生的外泌体已被报道在多种疾病中显示出强大的抗炎作用，如骨关节炎、心血管疾病、移植物抗宿主病和神经退行性疾病。作为一种由多泡体胞外分泌所产生的直径为30‑150nm的胞外小泡，外泌体可以被大多数类型的细胞释放，并存在于多种体液中。在磷脂双分子层的包裹中，它们含有丰富的生物活性物质，包括脂质、蛋白质和多种核酸等。因此，外泌体继承了其来源细胞的治疗作用，同时规避了与细胞治疗相关的一些安全问题。这种优势使它们有望成为治疗炎症的新方法，也使得最近研究者们对外泌体的兴趣激增。然而，由于外泌体的产量相对较低，且有效内容物含量较少，其实际应用仍受到限制。在实际操作中，尤其是在临床应用中，稳定的大规模外泌体供应是必不可少的。比较各种现有的外泌体分离方法发现，高纯度的外泌体分离方法往往收率较低。因此，在分离外泌体之前，寻求一种合适的策略来调控外泌体的分泌，甚至改变其内容物是十分必要的。理想情况下，将这种调控策略与外泌体的金标准分离方法(超高速离心)相结合将提高外泌体的产量并增强其治疗效果，而不会引入危险因素。作为一种安全、方便、低成本的物理方法，低强度脉冲超声是调控外泌体产生和促进其抗炎功能的一种很有潜力的非侵入性策略。目前有技术人员提出了低强度脉冲超声刺激促进细胞外泌体分泌的方法(如CN110777142A)，该方法实施后细胞分泌的外泌体量最高可达150％‑200％，但其刺激作用还是比较有限的，一定程度上也限制了其用途的拓展。

[0024] 下面结合部分实例对本发明做进一步介绍：

[0025] 超声刺激前的细胞培养

[0026] 在温度37℃，CO2浓度5％(气体分压)的细胞培养箱里培养小鼠骨髓来源的间充质6
干细胞浓度至80％，每个100mm培养皿内细胞数量约为3×10 个。移除培养皿中的培养基，沿皿壁加入PBS溶液1mL润洗细胞后，每一皿加入10mL含10％去外泌体胎牛血清的DMEM培养基，将细胞放回培养箱孵育12h。

[0027] 超声刺激

[0028] 细胞孵育稳定后，从培养箱中取出细胞，并用封口膜包裹培养皿，避免细胞污染。将实验组细胞置于如图1示例的超声刺激装置上，使用直径1.9cm的非聚焦超声探头分别在均匀分布于培养皿底部的集中1个区域刺激或5个区域进行刺激。5个区域进行刺激时每个区域刺激3min，共刺激15min，在超声刺激强度相同的情况下，集中模式和离散模式中超声刺激的总能量相同。使用的超声参数为：中心频率1MHz，占空比(DC)为20％，脉冲持续时间
2
为1ms，脉冲重复频率(PRF)为100Hz，超声探头声场能量强度(ISPPA)为300mW/cm ，超声刺激模式为脉冲超声刺激。对照组细胞放在同样的装置上，无超声刺激放置15min。随后移除封口膜，将细胞放回培养箱孵育，24h后收集培养基用于外泌体提取。如图2中所示，300mW/
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cm的超声刺激强度下，细胞分泌外泌体的数量最多，300mW/cm的超声刺激强度下，离散模
2 2
式组细胞分泌的外泌体约为集中模式组的1.9倍；并且在集中模式中100mW/cm 和300mW/cm强度下，细胞分泌数量没有明显变化。

[0029] 超声刺激后外泌体表征

[0030] 使用超高速离心法从收集的条件培养基中提取出外泌体。用NTA检测外泌体的浓度和粒径分布。透射电子显微镜(TEM)用于鉴定外泌体形态。用纳米流式技术检测外泌体的特征蛋白，包括CD9、CD63和CD81。如图3中所示，A)TEM下的外泌体形态，其具有典型的杯状囊膜结构；B)NTA分析两组外泌体粒径分布相似，均在50‑150nm的范围内；C)超声组外泌体含量较对照组有显著增加，提升至约3.66倍；D)纳米流式分析外泌体的表面标志物CD9、CD63和CD81。

[0031] 外泌体抗炎功能检测

[0032] RAW264.7细胞培养至60‑70％。然后随机分为4组:(1)对照组，(2)LPS组，(3)LPS+C‑Exos组，(4)LPS+LIPUS‑Exos组。对照组细胞用PBS预处理，其余3组细胞用LPS(100ng/mL)预处理3h。LPS+C‑Exos组和LPS+LIPUS‑Exos组细胞分别用15μg/mL的对照组外泌体(C‑Exos)和超声组外泌体(LIPUS‑Exos)处理20h。随后用ELISA和qRT‑PCR检测各组促炎因子和抑炎因子的表达。如图4中所示，A)ELISA检测不同组别RAW264.7细胞内抑炎因子IL‑10和促炎因子NF‑κB的表达；B)qRT‑PCR检测不同组别RAW264.7细胞内抑炎因子IL‑10和促炎因子NF‑κB的mRNA含量。结果显示相较于受LPS刺激且与对照组外泌体孵育的RAW264.7细胞(LPS+C‑Exos组)，受LPS刺激的RAW264.7细胞在与超声组外泌体孵育后(LPS+LIPUS‑Exos组)，其抑炎因子IL‑10的mRNA含量和蛋白表达量均显著增加，同时促炎因子NF‑κB的mRNA含量和蛋白表达量均显著降低，且也均优于集中刺激模式产生的外泌体的作用效果。

[0033] 本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。