[0001] 本发明涉及生物技术领域中，从人体体液或者细胞的培养液中提取外泌体及外泌体蛋白的方法。

[0002] 外泌体是哺乳动物细胞通过“内吞-外排”过程分泌到细胞外的一类囊泡状结构，直径约为30-150nm。外泌体不仅存在于细胞培养液中，也存在于血液、尿液、羊水、母乳、精液、唾液、胸腔积液等体液中，其组成包括脂质双分子层以及细胞来源相关的蛋白质、RNA、DNA等物质。几乎所有的细胞都可以产生外泌体，不同细胞来源的外泌体中既包含与细胞形成、结构和物质转运相关的共有成分，也包含与来源细胞的生物功能相关的特异分子。外泌体作为一种细胞间交流、传递大量的生物功能分子的重要方式日益受到重视。研究表明，外泌体在一系列生理和病理过程中起到至关重要的作用。肿瘤相关外泌体能够诱导癌症发生、参与肿瘤靶向转移、改善肿瘤生长的微环境、抑制免疫系统对肿瘤的免疫监督以及介导肿瘤细胞抗药性，对肿瘤外泌体的分析和检测有利于肿瘤的早期诊断、预后分析和疗效评价。

[0003] 目前常用的外泌体提取方法包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、体积排阻色谱、免疫亲和法。前四种方法基于外泌体独特的密度、尺寸等物理学参数实现提取，缺乏特异性，不能满足实际样本中肿瘤细胞外泌体特异性提取和分析的要求。尤其人体体液样本中，含有大量的低密度脂蛋白及乳糜微粒等微粒，这些微粒的粒径和密度与外泌体接近，绝大部分方法无法将其与外泌体分离开，从而对外泌体的后续分析造成干扰。

[0061] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0062] 下述实施例中的DMEM缓冲液为Gibico公司产品，货号31053-028。

[0063] 下述实施例中的PBS为Corning公司产品，货号：21-040-CVR。

[0064] 本发明提供了一种外泌体的提取方法，该方法包括：向含有外泌体的待提取液中加入提取材料提取得到外泌体；提取材料为金属氧化物或修饰有所述金属氧化物的功能材料；金属氧化物能与磷酸根离子发生双配位作用。

[0065] 下面以金属氧化物为TiO2、待提取液为人血清、细胞培养液和尿液为例具体阐述外泌体的提取方法。下述实施例中的离心，如无特殊说明，均在4℃进行。

[0066] 实施例1、外泌体提取

[0067] 一、人血清中外泌体的提取及其蛋白质的LC-MS/MS分析

[0068] 步骤1：血清样本预处理

[0069] 取100μL人血清(经该人知情同意)，按体积比1:1向血清中加入DMEM缓冲液稀释，得到血清稀释液；将血清稀释液进行梯度密度离心除去死细胞和/或细胞残渣，离心条件为：300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟，取上清液，将上清液经0.2μm滤膜过滤后，收集滤液，即为预处理后的血清样本。

[0070] 步骤2：血清样本中外泌体提取

[0071] 称取5mg TiO2，分别用纯水和DMEM缓冲液润洗2次，得到清洗后的TiO2；向清洗后的TiO2中加入步骤1得到的预处理后的血清样本200μL，得到提取混合物；将提取混合物在4℃下震荡(1500rpm)孵育5分钟后，在2000g下离心30秒，使外泌体进入沉淀中，收集沉淀；向沉淀中加入洗涤缓冲液(该缓冲液为PBS)震荡洗涤沉淀(洗涤通过在2000g下离心30秒收集沉淀完成)，得到洗涤后的沉淀；向洗涤后的沉淀中加入洗脱液(该洗脱液为10g/100mL的氨水)，得到洗脱混合物；将洗脱混合物在2000g下离心30秒，使外泌体进入上清夜中，收集上清液，即得到外泌体提取液；将得到的外泌体提取液在2000g下离心30秒，使外泌体进入沉淀中，收集沉淀，即得到外泌体。

[0072] 提取外泌体蛋白，利用western-blot检测其外泌体标志蛋白TSG101和CD9，结果如图1所示，结果显示，得到的外泌体中含有TSG101和CD9。

[0073] 步骤3：外泌体裂解及其蛋白质的LC-MS/MS分析

[0074] 将步骤2所得含有外泌体的材料(即洗涤后的沉淀)置于冰上，向其中加入18μL4g/100mL的SDS水溶液，然后超声(超声条件在100W下进行)裂解20分钟，得到超声产物；将超声产物在16000g下离心5分钟，收集全部上清液；向上清液中加入82μL 8M尿素水溶液和二硫苏糖醇，得到裂解液，该裂解液中二硫苏糖醇的浓度为20mmol/L；将该裂解液在37℃孵育4小时，得到裂解产物；将裂解产物转移至FASP管中，用8M尿素水溶液洗涤(FASP管是一种按分子量截留的管，洗涤过程都是通过离心完成，离心条件为14000g离心10分钟，离心以后，绝大部分溶液和小分子物质被离心至下层接收管子里，外泌体被截留在上层的FASP管中)2次；然后加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/L)，室温下避光反应1小时，用50mM碳酸氢铵水溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％(v/v)甲酸水溶液定容，得到外泌体蛋白提取液，将外泌体蛋白提取液上样进行LC-MS/MS分析，上样量为
1μg。

[0075] 采集质谱数据然后使用MAXQUANT搜目标数据库检索。所用目标数据库为RefSeq human database。检索参数设置为胰蛋白酶全酶切，设定2个蛋白酶漏切位点，蛋白质固定修饰选取Carbamidomethyl(C)，可变修饰为Oxidation(M)。质谱一级质量误差为15ppm，二级质量误差为0.6Da，假阳性率设为1％。

[0076] 结果显示，利用上述方法得到的血清外泌体蛋白的蛋白鉴定数为384，明显优于超速离心法(利用相同的方法进行蛋白质的鉴定，所得蛋白鉴定数为228)和商品化试剂盒(MinuteTM Hi-Efficiency Exosome  Precipitation Reagent，公司：Invent Biotechnologies,Inc，货号：CAT#EI-O27)(利用相同的方法进行蛋白质的鉴定，所得蛋白鉴定数为252)(图2)提取同一血清样本的蛋白鉴定数。Gene Ontology分析本发明提取的外泌体蛋白质的细胞成分，结果表明该方法所得蛋白质与外泌体功能更密切(图3)。表明，利用本发明的方法提取外泌体具有更好的提取效果。

[0077] 其中，利用超速离心法提取血清外泌体的步骤如下：取200微升血清，等体积加入PBS稀释后，4℃下2000g离心30分钟，取上清再用12000g离心45分钟，将上清用0.2μm滤膜过滤后，110000g离心70分钟，弃上清，底层沉淀部分用PBS清洗后，再经110000g离心70分钟，弃上清，沉淀部分即超速离心法所得血清外泌体。

[0078] 2、细胞培养液中外泌体提取

[0079] 2.1超速离心法提取外泌体

[0080] 用无外泌体的胎牛血清配置的培养液培养HeLa细胞24-48小时后，收集培养液；将培养液在4℃下，先经300g离心10分钟去除其中的细胞，再经2000g离心10分钟去除其中的死细胞，再经10000g离心30分钟，去除其中的细胞器等，收集上清液，将上清液110000g离心70分钟，沉淀中含有外泌体，将沉淀用PBS清洗后，再经110000g离心70分钟，收集沉淀，将沉淀部分再用PBS清洗后，再经110000g离心70分钟，收集沉淀即得到细胞培养液中的外泌体。

[0081] 2.2标准外泌体评价金属氧化物富集效果

[0082] 将步骤2.1所得外泌体分成数份作为标准外泌体，每份包含2μg蛋白含量对应的外泌体。取2mg TiO2，重悬于100μL DMEM缓冲液中，然后向其中加入1份标准外泌体，在4℃下，1500rpm震荡孵育5分钟，然后将孵育后所得悬浊液2000g离心30秒，沉淀部分用PBS清洗3次，每次洗完2000g离心30秒分离，最后收集沉淀部分，即富集有外泌体的TiO2。

[0083] 通过扫描电镜和透射电镜对富集有外泌体的TiO2进行表征，结果如图4所示,其中，a为未富集有外泌体的TiO2的扫描电镜表征图，b为富集有外泌体的TiO2的扫描电镜表征图，c和d为富集有外泌体的TiO2的透射电镜表征图，d为c的部分放大图。结果显示，TiO2可以成功富集到外泌体。

[0084] 2.3可逆洗脱实验(材料可重复利用)

[0085] 将步骤2.2所得富集有外泌体的TiO2用100μL 10g/100mL的氨水清洗，2000g离心30秒后，收集上清液至于FASP管中，用100μL PBS清洗2次后，分别对清洗后的材料及洗脱的上清液进行表征，结果如图5所示，其中a为氨水洗涤以后的TiO2材料的扫描电镜表征图，b为洗脱的上清液透射电镜表征图。表明，富集有外泌体的TiO2上的外泌体可被洗脱，得到的TiO2可重复利用。

[0086] 2.3利用金属氧化物直接提取细胞培养液中的外泌体

[0087] 将5mg TiO2加入至10mL步骤2.1得到的培养液中，用摇头机摇晃孵育30分钟后，2000g离心30秒，将沉淀用PBS清洗2次后，通过扫描电镜对其进行表征，结果如图6所示。结果显示，金属氧化物可以富集细胞培养液中的外泌体。

[0088] 3、尿液中外泌体提取

[0089] 收集晨尿20mL，依次经2000g离心10分钟，10000g离心30分钟后，将上清用0.2μm滤膜过滤后，加入5mg TiO2材料，用摇头机摇晃孵育30分钟后，2000g离心30秒，将沉淀用PBS清洗2次后，通过扫描电镜对其进行表征，结果如图7所示。结果显示，金属氧化物可以富集尿液中的外泌体。